固定化酶微反應(yīng)器的應(yīng)用
上個(gè)世紀(jì)90年代,庫爾團(tuán)隊(duì)開始利用酶微反應(yīng)器結(jié)合毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行線酶解和谷氨酸鹽分析。Fréchet和Svec研究組利用整體柱酶微反應(yīng)器進(jìn)行肽譜分析和抗體的研究。目前,固定化酶微反應(yīng)器的穩(wěn)定性和催化效率均有了顯著的提高,已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
作為繼人類基因組計(jì)劃后的又一重大生命科學(xué)課題,蛋白質(zhì)組學(xué)是一個(gè)非常復(fù)雜的生物系統(tǒng)工程。作為shotgun技術(shù)的補(bǔ)充,固定化酶微反應(yīng)器為蛋白質(zhì)組學(xué)的順利實(shí)施提供了有力的支撐。利用所制得的全柱酶微反應(yīng)器和納米反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),首次實(shí)現(xiàn)了復(fù)合蛋白混合物的酶解分析。
結(jié)果表明,在590ng酵母蛋白酶解產(chǎn)物中,共鑒定出1578個(gè)獨(dú)立肽段,541個(gè)不同蛋白,酶解時(shí)間從16小時(shí)縮短到1分鐘。Liu團(tuán)隊(duì)將制備的納米金膠芯片酶反應(yīng)器與強(qiáng)陽離子交換-反相層析-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用,對小鼠巨噬細(xì)胞系A(chǔ)MJ2-C8蛋白樣品進(jìn)行酶解和快速分離測定,共497個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的鑒定。在此基礎(chǔ)上,Zhang團(tuán)隊(duì)利用微反應(yīng)器構(gòu)建了多維蛋白質(zhì)分析平臺,為蛋白質(zhì)組學(xué)的高通微量化分析研究奠定了基礎(chǔ)。
研究人員使用具有氨基功能的全復(fù)合柱胰蛋白酶微反應(yīng)器與μPRLC-ESI-/MS/MS/MS/MS聯(lián)用,構(gòu)建了一種在線蛋白變性、還原、酶解、分離、檢測等蛋白質(zhì)分析平臺,使蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理時(shí)間縮短到3.5min。再將點(diǎn)擊麥芽糖親水作用色譜柱、強(qiáng)離子交換預(yù)柱、肽-N-糖苷酶F微反應(yīng)器組成的多級處理系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了多級蛋白樣品處理系統(tǒng)的同步實(shí)現(xiàn),能同時(shí)進(jìn)行多肽富集、樣品緩沖液的更換以及脫糖基化。
首次用于蛋白質(zhì)N-連接糖基化位點(diǎn)的研究,可選擇性地檢測酶解產(chǎn)物糖基糖肽,來自抗生素共存干擾物50倍以上。同時(shí),樣品的預(yù)處理時(shí)間也只需1h左右,而樣品的檢測限值僅為5fmol。與nanoRPLC-ESI-MS/MS相結(jié)合,對6μg大鼠腦液酶解樣品進(jìn)行了分析檢測,共檢測到120個(gè)糖蛋白和196個(gè)N-糖基化位點(diǎn)肽,其中有61個(gè)是首次發(fā)現(xiàn)的。本系統(tǒng)對高通量、高效、高靈敏度的糖蛋白組學(xué)檢測具有重要意義。酶微反應(yīng)器還可以用于藥物的高通量篩選。
酶靶向抑制劑藥物的篩選是目前分子靶向藥物研究的一個(gè)重要方向。酶微反應(yīng)器是一種高效、自動(dòng)化的藥物篩選方法,但傳統(tǒng)的藥物篩選方法效率低、能耗高。阿茲海默病(AD)被稱為老年癡呆癥,是一種廣泛關(guān)注的老年疾病。AD的發(fā)生與乙酰膽堿酯酶(AChE)密切相關(guān),在臨床上應(yīng)用較多的是AchE抑制劑。
通過CE和AchE的聯(lián)合應(yīng)用,對AChE抑制劑進(jìn)行了篩選,從40多個(gè)天然藥物庫中快速篩選到4個(gè)AchE抑制劑。由于CE篩選出的藥物峰容量不足,用磁性聚苯乙烯微球作為載體,結(jié)合CE進(jìn)行堿性磷酸酶毛細(xì)管微反應(yīng)器的篩選,峰容量提高了20倍??拱┧幬锴八幓钚允撬幬镩_發(fā)的重要組成部分。通過與HPLC相結(jié)合,對硝基苯硝基還原酶進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。在線酶抑制劑的篩選中,毛細(xì)管整體柱腺苷脫氨酶酶反應(yīng)器與nanoLC相結(jié)合。酶微反應(yīng)器作為一種綠色環(huán)保、高效易控的催化合成技術(shù),近年來在生物轉(zhuǎn)化方面也日益受到關(guān)注。
采用白念珠菌酯酶B反應(yīng)器進(jìn)行內(nèi)酯聚合,可以得到比傳統(tǒng)聚合反應(yīng)大得多的產(chǎn)物。采用脂肪酶PS微膜反應(yīng)器進(jìn)行了苯醇和醋酸乙烯酯的手性催化酯交換反應(yīng),3維立方結(jié)構(gòu)MPS膜載體制備的微反應(yīng)器,轉(zhuǎn)化率高達(dá)64%,手性選擇性大于99%。
采用酯酶微反應(yīng)器對乙酸異戊酯進(jìn)行生物合成,比傳統(tǒng)方法提高3倍。在此基礎(chǔ)上,采用脂肪酶反應(yīng)器選擇性合成C-6位羥基乙酰化。本發(fā)明的反應(yīng)時(shí)間縮短到30分鐘,并具有較高的收率和選擇性。同時(shí),利用酶微反應(yīng)器對酶性能進(jìn)行評價(jià)。以葡萄糖氧化酶為模型,用固定化酶微反應(yīng)器研究酶動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,微反應(yīng)器富集酶活性較好,酶學(xué)參數(shù)與濃度有較好的線性關(guān)系。酶的活性是微反應(yīng)器的一個(gè)重要性能指標(biāo)。對酶活性評價(jià)方法進(jìn)行了相關(guān)研究,為活性表征提供了簡便而有效的方法。
用胰蛋白酶結(jié)合纖維素膜形成一種填充層析。采用HPLC前沿分析方法,在線監(jiān)測胰蛋白酶底物N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺的水解產(chǎn)物中硝基苯胺的含量,并計(jì)算胰蛋白酶底物中硝基苯胺的含量,從而評價(jià)固定酶活性。用胰蛋白酶在多孔硅載體上進(jìn)行共價(jià)鍵合,與離子化質(zhì)譜相結(jié)合,檢測酶催化底物產(chǎn)生的產(chǎn)物的量,從而測定酶活性。
另外,多種酶結(jié)構(gòu)的微反應(yīng)器也被廣泛應(yīng)用于生化級聯(lián)反應(yīng)。以蔗糖酶、葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在微通道中分段固定,通過反應(yīng)物進(jìn)入通道,通過調(diào)節(jié)三種酶的固定順序,觀察酶的生成順序?qū)Ξa(chǎn)生產(chǎn)量的影響。用谷氨酸脫氫酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶同時(shí)固定于毛細(xì)管內(nèi)壁,通過循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生信號放大效應(yīng),用于谷氨酸含量的高靈敏度檢測。
標(biāo)簽:   微反應(yīng)器