分享一篇2017年2月的PNAS，來(lái)自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的工作，超低成本的稀有細(xì)胞分離富集微流控芯片，充滿了工程學(xué)的解決問(wèn)題思路，我覺(jué)得是很出色的工作。

稀有細(xì)胞（rare cells）是指含量<100個(gè)細(xì)胞/毫升全血的細(xì)胞，這些細(xì)胞在血液和組織中含量非常少，例如干細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞核殘留病變細(xì)胞。分離檢測(cè)稀有細(xì)胞對(duì)于重大疾病的早期診斷有非常重要的作用，例如瘧疾、肺結(jié)核、艾滋病和癌癥，這些致命疾病如果能通過(guò)對(duì)稀有細(xì)胞的分析完成早期診斷，控制病情乃至治愈的可能性將大大提高，減少病患痛苦，減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

要實(shí)現(xiàn)這一目的，就要求從復(fù)雜的血液體系中快速準(zhǔn)確地分離出我們想要檢測(cè)的少量目的細(xì)胞并進(jìn)行分類處理、純化或富集。目前常用的實(shí)驗(yàn)室分析通常需要對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，引入外來(lái)標(biāo)記分子以增強(qiáng)檢出敏感度，但是這種手段可能會(huì)使得后續(xù)純化步驟非常復(fù)雜，而且標(biāo)記物有可能影響細(xì)胞原有性質(zhì)。非常復(fù)雜，耗時(shí)耗力，花費(fèi)也很高。

近些年非常熱門(mén)的芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip, LOC）概念或許能解決這一困難。LOC指的是將一系列實(shí)驗(yàn)室操作集成到一個(gè)非常小的芯片上，只需極少量（微升甚至納升級(jí)別）液體樣品，就可以在生物芯片上自動(dòng)完成操控分析。在許許多多的實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)當(dāng)中，電動(dòng)力學(xué)相關(guān)的技術(shù)尤其適合在芯片上實(shí)現(xiàn)，因?yàn)殡妶?chǎng)的方向、頻率、振幅等參數(shù)都很容易精確控制，而且電泳、電滲、滲透電泳、毛細(xì)滲透等原理在生化分析方面有非常廣泛而重要的應(yīng)用。利用各向異性電場(chǎng)誘導(dǎo)受試樣品（血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血小板、蛋白質(zhì)、DNA分子等等）產(chǎn)生電偶極矩，就可以將不同性質(zhì)的生物樣品分離開(kāi)，而且通過(guò)操控電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的生物樣品分析不需要引入外來(lái)標(biāo)記物，避免了標(biāo)記可能帶來(lái)的問(wèn)題。

LOC技術(shù)具有的快速、準(zhǔn)確、無(wú)外來(lái)標(biāo)記物等特點(diǎn)使其非常適合與即時(shí)檢測(cè)（point of care testing, POC testing）相結(jié)合，然而目前仍少有這方面的研究報(bào)道。即時(shí)檢測(cè)，又稱床邊檢測(cè)，顧名思義指的是就近、簡(jiǎn)便、迅速的檢測(cè)手段。能夠短時(shí)間在患者身邊進(jìn)行簡(jiǎn)單的檢查和診斷，有利于醫(yī)生和護(hù)士進(jìn)行迅速處理?；颊咭部梢栽诩易孕惺褂肞OC設(shè)備，就可以方便對(duì)慢性疾病的持續(xù)性檢查。而在醫(yī)療條件仍比較落后的發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)，POC檢測(cè)對(duì)于上文提到的瘧疾、HIV、腫瘤等致命疾病的早期診斷具有非常重要的作用，而盡早診斷并介入治療可有效提高病患存活率并降低醫(yī)療支出，因此開(kāi)發(fā)低成本的POC檢測(cè)設(shè)備對(duì)于發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)醫(yī)療具有重要意義，這也正是這一工作的研究目標(biāo)。

這一工作的主要內(nèi)容是將LOC技術(shù)應(yīng)用于POC檢測(cè)，制造超低成本、一次性可拋棄的生物芯片，用于稀有細(xì)胞的分離與富集，以發(fā)展快速、便捷、廉價(jià)的重大疾病早期檢測(cè)方案。

這一工作設(shè)計(jì)的微流控納米噴墨電子檢測(cè)平臺(tái)為多層堆疊結(jié)構(gòu)，下層是具有微孔結(jié)構(gòu)的PET（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，polyethylene terephthalate）柔性高分子薄膜，表面由可導(dǎo)電納米粒子噴印形成電路結(jié)構(gòu)；上層是PDMS（聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane）微流控芯片；中間層是絕緣薄膜，用于分隔開(kāi)微流控芯片和電路結(jié)構(gòu)，圖1所示即為平臺(tái)裝置示意圖。噴墨打印的分辨率可達(dá)20微米，整個(gè)平臺(tái)設(shè)備成本只需1美分，約20min即可制作完成。

圖1. 微流控納米噴墨電子檢測(cè)平臺(tái)設(shè)計(jì)示意圖 A)用噴墨打印機(jī)將含導(dǎo)電納米顆粒的“墨水”噴印在PET底物薄膜上形成電路；B）1. PET柔性電路板；2. 粘附在絕緣膜上的PDMS微流控芯片

在這一平臺(tái)中，絕緣層和微流控芯片為一次性使用后即可拋棄的，而PET柔性電路板可回收并重復(fù)使用，同時(shí)開(kāi)發(fā)者可以通過(guò)開(kāi)源軟件自主設(shè)計(jì)電路，使這個(gè)平臺(tái)擁有非常高的擴(kuò)展性，可實(shí)現(xiàn)各類檢測(cè)目標(biāo)，圖2為實(shí)物圖。這種使用微流控芯片的檢測(cè)方式不需要任何標(biāo)記物，即可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。 

圖2. D)檢測(cè)平臺(tái)實(shí)物圖 F) PET柔性電路板實(shí)物圖

為了驗(yàn)證噴墨微流控測(cè)試平臺(tái)的作用，將不同尺寸（直徑5微米和10微米）的PS（聚苯乙烯，polystyrene）微球表面包覆上鏈霉親和素，制成PMS微球以模擬細(xì)胞，這種微球的大小和形狀都與細(xì)胞相類似，同時(shí)實(shí)驗(yàn)還用到了酵母細(xì)胞和乳腺癌腫瘤細(xì)胞株（MDA-MB-231），以檢驗(yàn)該平臺(tái)在含有多種細(xì)胞的非均相體系中的作用。

通過(guò)微流控芯片設(shè)計(jì)以及柔性電路板可控電場(chǎng)的作用，這一裝置可以實(shí)現(xiàn)的功能有：

（1）從多元體系中限制住單個(gè)生物粒子

如圖3.A所示為平臺(tái)示意圖，底下三條橫杠是PET柔性電路板上的電極，上面一塊半透明的即為PDMS微流控芯片，中央是一道微流控管道。在低電場(chǎng)強(qiáng)度的條件下，微流控管道中間將形成電勢(shì)阱（圖3.B 電勢(shì)分布曲線中間最低點(diǎn)），如果沒(méi)有外來(lái)施加的能量，生物粒子無(wú)法偏離電勢(shì)最低處。從圖3.C的微流控芯片三維電勢(shì)圖可以清楚看到，芯片表面電勢(shì)如山巒起伏，橫向貫穿的管道中電勢(shì)較低如山谷，而管道縱橫交匯處三個(gè)深藍(lán)色的坑，就是勢(shì)能最低點(diǎn)，即為足以限制住生物粒子的勢(shì)阱。從顯微照相圖（圖3.D）中也可以看到，PMS微球被限制在設(shè)計(jì)好的陷阱中動(dòng)彈不得。（說(shuō)實(shí)話他不圈出來(lái)我肯定看不出那里停了個(gè)球）

圖3. 多元復(fù)雜體系中單個(gè)生物粒子限制功能 A)微流控芯片示意圖；B)微流控管道內(nèi)電勢(shì)分布；C)三維電勢(shì)圖；D)顯微照相圖

（2）在不需要標(biāo)記物的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞選擇性分析分類并分離出想要的細(xì)胞

同樣圖4.A所畫(huà)的是這一裝置的示意圖，在分離分析細(xì)胞這一功能中，微流控管道的形狀與之前有所不同，為三叉戟（嗯？）的形狀，由于不同生物粒子在電場(chǎng)極化后帶有不同的偶極矩，它們?cè)陔妶?chǎng)中的行為也會(huì)不同，憑借這一特點(diǎn)，它們將在微流控管道的岔路口分道揚(yáng)鑣，實(shí)現(xiàn)分類分析的功能。將管道中電勢(shì)分布畫(huà)出來(lái)即如圖4.B、4.C所示，在管道的偏左偏右有兩條勢(shì)能非常高的區(qū)域，橫截面的電勢(shì)分布即為圖4.D，與圖4.C相符。在熒光顯微（圖4.E左）和明場(chǎng)照相（圖4.E右）中可以觀察到，乳腺癌細(xì)胞和酵母細(xì)胞會(huì)流向帶負(fù)電的區(qū)域，而PMS微球全部聚集在右邊帶正電的區(qū)域，分離效果比較好。

圖4. 無(wú)標(biāo)記物分類分離細(xì)胞功能A)微流控芯片示意圖；B)微流控管道內(nèi)電勢(shì)分布計(jì)算圖；C)電勢(shì)分布局部放大；D)橫截面電勢(shì)分布圖；E)顯微照相圖

（3）稀有細(xì)胞濃縮富集，也并不需要標(biāo)記物

電極設(shè)計(jì)示意圖如圖5.A，在電極組成的十字路口，四周的電勢(shì)是不同的，因此十字路口斜對(duì)角電勢(shì)分布如圖5.B所示，在唯一一塊帶正電的電極附近達(dá)到了最高值。因此可以確定，帶負(fù)電的細(xì)胞只能富集在此處。源源不斷的細(xì)胞流向此處，只能在這里停留，也就實(shí)現(xiàn)了濃縮，圖5.C和5.D中就可以看到，乳腺癌細(xì)胞全部聚集在十字路口的這一頭。如果我們改一改電極所帶的電荷情況，比如說(shuō)改成圖5.E這樣，富集區(qū)域就會(huì)跟著改變（圖5.F&5.G）。

在圖中橙色虛線為電極邊緣，藍(lán)色虛線為微流控管道邊界。熒光疊加的細(xì)胞軌跡圖中，紅色為細(xì)胞，藍(lán)色為大量細(xì)胞聚集區(qū)域。

圖5. 稀有細(xì)胞濃縮富集 A)微流控芯片示意圖；B)電勢(shì)分布圖；C)熒光顯微照片觀察到細(xì)胞富集；D)細(xì)胞軌跡疊加；E)改變電極帶電情況；F)改變電場(chǎng)后富集區(qū)域改變；G)細(xì)胞軌跡疊加

（4）實(shí)時(shí)單細(xì)胞計(jì)數(shù)

這一功能的電極設(shè)計(jì)也非常巧妙，在微流控管道兩側(cè)，前后有兩對(duì)矩形電極，而中間的電極是兩塊相對(duì)的三角形（圖6.A），當(dāng)單個(gè)細(xì)胞通過(guò)此處時(shí)，電場(chǎng)將發(fā)生變化，借此電信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖6.B即為單個(gè)細(xì)胞通過(guò)三角形電極中間管道時(shí)的顯微照片。此時(shí)這一平臺(tái)的橫截面電路可以等效簡(jiǎn)化為圖6.C，灰色平臺(tái)上紅色的兩側(cè)電極形成了一個(gè)電容器，粉色的絕緣層也是電容，微流控芯片和液體帶有電阻R，而實(shí)時(shí)通過(guò)的單個(gè)細(xì)胞電阻為△R，將電場(chǎng)線畫(huà)出來(lái)就可以得到6.D圖。實(shí)驗(yàn)中用到的電源為12V 900千赫茲的交流電，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞通過(guò)時(shí)，電極兩側(cè)電壓，也就是電容器兩端的電壓有明顯的降低，如圖E所示，就是有6個(gè)PMS微球逐一通過(guò)的電勢(shì)圖，可以看到明顯的6個(gè)峰。

圖6. 實(shí)時(shí)單細(xì)胞計(jì)數(shù) A)微流控芯片示意圖；B)單個(gè)細(xì)胞通過(guò)電極顯微照相圖；C)等效電路圖；D)單個(gè)細(xì)胞通過(guò)的電勢(shì)計(jì)算圖；E)6個(gè)PMS微球通過(guò)的實(shí)驗(yàn)測(cè)量電勢(shì)圖

這篇文章還完成了一些其他工作，例如確保生物芯片對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，畢竟我們不希望一頓操作猛如虎，最后分析了一堆死細(xì)胞；調(diào)整液體在管道中的流速、電場(chǎng)的最適強(qiáng)度和頻率等等。然而真正使這一工作稱得上是芯片實(shí)驗(yàn)室（LOC）的，我覺(jué)得是，以上所有功能可以集成在同一片微流控芯片上（圖7）。

圖7. 全功能微流控納米噴墨電子檢測(cè)平臺(tái)示意圖

在不同區(qū)域可以實(shí)現(xiàn)上述各種功能，這樣一來(lái)整個(gè)流程就是：加入一滴（微升到納升級(jí)別）液體樣本，經(jīng)過(guò)（a）分選艙，不同細(xì)胞分開(kāi)，我們不關(guān)心的部分就從（b）排出，而我們想要檢測(cè)的細(xì)胞由于電勢(shì)阱被限制在（c）處等待收割。如果稀有細(xì)胞量太少了，那就送到（d）富集一下，對(duì)于我們想計(jì)數(shù)的細(xì)胞，在通過(guò)（e）之前注射一些磷酸緩沖液（PBS）稀釋一下，然后一個(gè)個(gè)計(jì)數(shù)。要是想分析多種細(xì)胞？送到下一個(gè)岔路口再來(lái)一次。

只用了你一滴血而已。

柔性PET電路甚至是開(kāi)源設(shè)計(jì)的，研究人員和醫(yī)生可以交流設(shè)計(jì)方案、免費(fèi)下載可靠的電路圖、花20分鐘用噴墨打印機(jī)打印下來(lái)。在可能的應(yīng)用場(chǎng)景中，醫(yī)生從兜里掏出一把塑料紙，挑挑揀揀抽出一張PET電路板，再?gòu)牧硪粋€(gè)口袋里拿出滅菌封裝好、隨取隨用的微流控芯片，撕開(kāi)包裝擺在電路板上。扎你中指取血是免不了的了，你還在那兒齜牙咧嘴疼呢，醫(yī)生反手一個(gè)毛細(xì)管吸上100微升血樣已經(jīng)加到芯片上了。過(guò)不了多久，醫(yī)生就能拿到足量的稀有細(xì)胞進(jìn)行下一步檢查。PDMS芯片隨手就扔了，PET電路板繼續(xù)揣兜里。

原文：Esfandyarpour, R., et al. (2017). "Multifunctional, inexpensive, and reusable nanoparticle-printed biochip for cell manipulation and diagnosis." Proc Natl Acad Sci U S A 114(8): E1306-E1315.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28167769/

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