病原微生物的快速檢測對疫情的預防控制至關(guān)重要?；?/span> PCR 的病原微生物核酸檢測方法克服了傳統(tǒng)病原微生物培養(yǎng)方法耗時長、免疫學檢測存在窗口期等問題。然而，對精確控溫熱循環(huán)儀的依賴卻嚴重限制了其在資源匱乏地區(qū)的應(yīng)用。雖然基于核酸等溫擴增的病原微生物檢測方法可擺脫對高精度溫控設(shè)備的依賴，但仍需要進行樣本核酸分離提取、擴增與檢測等步驟。近年來，微流控技術(shù)與核酸等溫擴增技術(shù)相結(jié)合，誕生了多種病原微生物等溫擴增微流控檢測技術(shù)。該技術(shù)通過設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)、優(yōu)化進樣模式及檢測方式，實現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴增與檢測一體化，并具備多重檢測、定量檢測等功能，具有對儀器依賴度小、對操作人員要求不高、樣本量需求小和自動化程度高等優(yōu)點，適合于在多種環(huán)境下的病原微生物快速檢測。

基于重組酶聚合酶擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

2006 年，Piepenburg等[1]首次提出了重組酶聚合酶擴增反應(yīng)(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結(jié)合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫擴增。首先，T4 uvsX 在輔助因子 uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復合物，然后該復合物尋找與靶標 DNA 的互補區(qū)域進行雜交并置換下另一條單鏈，置換下的單鏈馬上被 gp32結(jié)合防止其再與互補鏈雜交，最后 T4 uvsX 在 ATP 的作用下與引物解離，聚合酶 Bsu 與引物結(jié)合并沿模板進行延伸(圖 1)。該反應(yīng)在37~42℃下 30 min 內(nèi)可以獲得1012拷貝的擴增產(chǎn)物，其靈敏度可達到單拷貝，其擴增產(chǎn)物長度在500 bp 以內(nèi)最佳[1]。由于RPA反應(yīng)快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點，因此易于與微流控芯片結(jié)合開發(fā)出對病原微生物的即時檢測(point-of-care testing,POCT)技術(shù)。

圖1 重組酶聚合酶擴增反應(yīng)基本原理

Fig. 1 Principle of recombinase polymerase amplification

1：在重組酶作用下，引物與靶序列結(jié)合；2：引物與靶序列結(jié)合后置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合；3：在聚合酶作用下進行延伸，同時置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合；4：同源雙鏈分離，持續(xù)延伸；5：形成新的雙鏈，并進行下一個循環(huán)。

基于環(huán)介導等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi 等[2]于2000 年首次發(fā)表，該反應(yīng)原理如圖 2 所示。針對待測靶標設(shè)計一對外引物F3、B3 和一對內(nèi)引物FIP、BIP，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA 聚合酶)作用下，引物沿模板發(fā)生延伸和鏈置換反應(yīng)，產(chǎn)生長短不一的靶標重復片段，該反應(yīng)通常在60~65℃進行，1 h 內(nèi)將待測靶標擴增109倍以上，靈敏度可達到檢測 10 拷貝的待測靶標。通過額外引入一對環(huán)狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并使反應(yīng)時間縮短至 30 min 內(nèi)。鑒于 LAMP 靈敏度高、檢測方式多樣、反應(yīng)速度快等優(yōu)點，近年來發(fā)展了很多LAMP 微流控芯片，它們在進樣方式、產(chǎn)物檢測方法等方面各有千秋，在病原微生物核酸檢測方面均具有較好的應(yīng)用前景。

圖 2環(huán)介導等溫擴增原理

Fig. 2 Principle of loop-mediated isothermal amplification

A：LAMP外引物F3/B3 和內(nèi)引物FIP/BIP 與靶標互補的6 個區(qū)域，如其中F3 與F3c 互補，B3 與B3c互補；B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)物生成步驟，引物FIP 通過F2 區(qū)域與模板鏈F2c 結(jié)合并進行延伸，之后F3 與靶標F3c 結(jié)合并進行鏈置換反應(yīng)，F(xiàn)IP延伸產(chǎn)物被替換釋放，釋放的單鏈末端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。BIP 和B3 以相似的方式進行，生成兩端具有環(huán)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物5。C：循環(huán)放大步驟，結(jié)構(gòu)5以自身為模板，從3’末端F1 區(qū)域開始自引發(fā)DNA 合成，同時FIP 退火至環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的F2c 區(qū)域并進行延伸得到結(jié)構(gòu)6。結(jié)構(gòu)6以自身為模板延伸，置換下與結(jié)構(gòu)5 互補的產(chǎn)物7。結(jié)構(gòu)7 到結(jié)構(gòu)8 再到結(jié)構(gòu)5 與結(jié)構(gòu)5 到結(jié)構(gòu)6 再到結(jié)構(gòu)7 類似。結(jié)構(gòu)9 和結(jié)構(gòu)10分別由結(jié)構(gòu)6 和結(jié)構(gòu)8 生成。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FIP/BIP 引物的共同作用下生成含有多個重復靶標序列的結(jié)構(gòu)11、12。

基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

 基于滾環(huán)擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA 聚合酶催化的等溫擴增反應(yīng)，需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環(huán)狀模板，引物與環(huán)狀模板匹配后在DNA 聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不斷置換先前產(chǎn)生的延伸鏈，最終產(chǎn)生重復的長單鏈DNA 產(chǎn)物(圖 3A)。在RCA 基礎(chǔ)上通過引入與延伸產(chǎn)物退火雜交的另一條或多條引物可形成超分支RCA，實現(xiàn)超指數(shù)式擴增；或通過偶聯(lián)RCA 與核酸侵入反應(yīng)實現(xiàn)低成本、高靈敏、高特異性的信號放大核酸檢測。Jiang 等開發(fā)了一款RCA 芯片，其通道內(nèi)修飾的適配體可捕獲病原微生物，再通過另一適配體引物與菌體結(jié)合形成“三明治”結(jié)構(gòu)，利用適配體引物引發(fā)RCA 反應(yīng)進行信號放大，最后通過熒光探針的雜交進行檢測(圖 3B)，該方法可檢測102個細胞/mL 的E. coli O157:H7。但由于RCA 需要鎖式探針首先與靶標連接成環(huán)，連接與擴增步驟一般不在同一體系進行，因此較難開發(fā)集提取、擴增和檢測于一體的RCA 微流控芯片。

圖3 RCA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 3 Principles of RCA and the microfluidic chip

A：RCA擴增原理，環(huán)狀模板兩端與連接模板退火，并進行連接，使模板成環(huán)，之后引物與環(huán)狀模板退火后經(jīng)DNA聚合酶進行延伸，最終可得到一條含有多個重復模板序列的長DNA 單鏈。B：RCA微流控芯片，在微流控內(nèi)壁修飾由適配體，可將大腸桿菌特異性捕獲。適配體-引物復合體與被捕獲的大腸桿菌結(jié)合，引物以環(huán)狀DNA為模板進行延伸，通過熒光探針對延伸產(chǎn)物進行檢測。

基于依賴核酸序列擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

1991年，加拿大Cangene Corporation 公司Jean Compton 實驗室首次提出依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA 為模板，在恒溫條件下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA 聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復制機制對目標RNA 進行擴增(圖 4A)，90min 內(nèi)可以將靶標擴增至1012，其產(chǎn)物長度為 100~250 bp，靈敏度可達檢測單個拷貝的靶標分子。Wang 等發(fā)展了一種可以進行數(shù)字化檢測的 NASBA芯片(dNASBA)，如圖 4B所示，沿芯片主通道分布多個獨立小室，小室最末端伸出分支通道與主通道相通。首先通入油相排除芯片腔體內(nèi)的空氣，進樣口加入水相體系并在出樣口連接負壓，基于流體的固有性質(zhì)及芯片結(jié)構(gòu)，液體會經(jīng)主通道自動填充至每個分離的小室，但不會進入分支通道，再加入油相填充主通道使每個小室體系隔離，完成反應(yīng)體系的數(shù)字化分布。然而，NASBA擴增步驟多，反應(yīng)體系較復雜，不易開發(fā)成微流控檢測芯片，因此基于NASBA 的病原微生物檢測芯片鮮有報道。

圖4 NASBA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 4 Principles of NASBA and the microfluidic chip

A：NASBA 擴增原理，含有T7 序列的引物1 與靶RNA雜交，進行逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，加Rnase 使RNA 降解，并加入引物2 與DNA 雜交延伸，生成雙鏈DNA。由雙鏈DNA 經(jīng)T7 RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄生成RNA。然后進行循環(huán)。最終生成大量RNA 經(jīng)熒光探針進行檢測。B：NASBA數(shù)字化微流控芯片，首先在干凈的芯片通入油相填充真?zhèn)€芯片，再加入反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系填充至每個小室。由于小室底部通道疏水，因此并不會經(jīng)小室底部的通道流出。最后再通油相封閉主通道，使每個小室獨立分隔。形成數(shù)字化液滴芯片。

基于解旋酶依賴性擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

在體內(nèi)，DNA 通過解旋酶、DNA 聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復制，Vincent 等模仿這一過程開發(fā)出了體外解旋酶依賴性擴增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理如圖 5A 所示，首先DNA 雙鏈被DNA 解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結(jié)合，之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交，在DNA 聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸，合成新的雙鏈，在37℃ 條件下反應(yīng)1~2 h 可獲得106倍的擴增產(chǎn)物，其靶序列在400 bp 范圍內(nèi)可以得到有效擴增。Mahalanabis 等開發(fā)了一種μSPE-HDA 芯片，可直接將樣本裂解液注入芯片進樣孔，流經(jīng)芯片內(nèi)置的固相萃取色譜柱，之后進行洗滌洗脫完成DNA 的提取，再將提取的 DNA 和 HDA 反應(yīng)體系直接注入混合室，經(jīng)混勻后進入反應(yīng)室(整個過程通過瓣閥控制廢液、洗脫液和體系的流向) (圖 5B)。然而，HDA 反應(yīng)體系復雜，反應(yīng)過程難以控制，給基于 HDA 的微流控芯片設(shè)計帶來了困難。

圖5. HDA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 5 Principles of HDA and the microfluidic chip

A：HDA擴增原理，首先雙鏈DNA 經(jīng)解旋酶解旋，單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合。引物與單鏈特異性雜交后經(jīng)聚合酶延伸，最后形成新的雙鏈；B：HDA微流控芯片，芯片內(nèi)置SPE 提取柱、反應(yīng)單元、廢液池，各位置開關(guān)閥門可控制液體流向。反應(yīng)末端為疏水出氣孔，可在滿足進樣的同時防止液體流出。各種核酸等溫擴增技術(shù)在反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件、檢測方式等方面均各有優(yōu)劣(表1)，但它們依然離不開核酸提取、擴增與產(chǎn)物分析等步驟，如何簡化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現(xiàn)場快速檢測的關(guān)鍵[3]。而構(gòu)建集病原微生物預處理、核酸提取、擴增與檢測于一體的等溫擴增芯片是未來的發(fā)展方向，并且為了發(fā)展適用于極端惡劣環(huán)境的病原微生物POCT芯片，如何降低對儀器設(shè)備的依賴性、增強芯片及反應(yīng)體系的穩(wěn)定性、提高檢測的特異性與定量性能始終是等溫擴增病原微生物檢測芯片需要克服的技術(shù)瓶頸。相信隨著微流控技術(shù)與核酸等溫擴增檢測技術(shù)的發(fā)展，會出現(xiàn)定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫擴增病原微生物檢測芯片技術(shù)，使病原微生物即時檢測向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發(fā)展。

表 1  不同核酸等溫擴增技術(shù)比較

Table 1 Summary and comparison of different nucleic acid isothermal amplification methods