生物芯片的技術(shù)核心(下)
4、探針的制備技術(shù)
探針(探針的功能是識(shí)別靶序列和攜帶報(bào)告分子,如同位素、熒光、地高辛等):為了提高監(jiān)測(cè)靈敏度,人們的努力放在信號(hào)放大以及模板擴(kuò)增兩個(gè)方面,其中應(yīng)用經(jīng)過(guò)特殊處理的探針?lè)椒梢蕴岣哽`敏度的方法有三種:分支探針這種方法的原理是,設(shè)計(jì)具有龐大分支結(jié)構(gòu)的分支核苷酸探針,分支末端以酶標(biāo)記。這樣,經(jīng)過(guò)分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標(biāo)本雜交時(shí)極弱的信號(hào)轉(zhuǎn)換為較強(qiáng)的化學(xué)信號(hào)。分子信標(biāo)(Molecular beacon, MB,一種設(shè)計(jì)巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針,未雜交狀態(tài)下為發(fā)夾結(jié)構(gòu),在發(fā)夾的兩端分別連接熒光素分子和猝滅分子,利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(FRET))、肽核酸(Peptide nucleic acids, PNA,以中性酰胺鍵為骨架,不帶電荷,為DNA類(lèi)似物。與DNA的親和性高、酶解穩(wěn)定性好,因此多用來(lái)做診斷和檢測(cè)用探針)探針3項(xiàng)技術(shù)。
5、雜交反應(yīng)及過(guò)程控制技術(shù)
芯片雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。雜交時(shí)選擇的條件要使成千上萬(wàn)對(duì)的雜交反應(yīng)中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中,也就是說(shuō)要使得盡可能多的正確配對(duì)物都不遺漏(假陰性盡可能少),有錯(cuò)配的雜交降低至最低(假陽(yáng)性盡量少),這是非常難以達(dá)到的境界。目前雜交是提高芯片在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。雜交條件的構(gòu)建要根據(jù)芯片的實(shí)際情況進(jìn)行最優(yōu)化。
雜交反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,受很多因素的影響,而雜交反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些影響因素包括:(1)寡核苷酸探針密度的影響。低覆蓋率使雜交信號(hào)減弱,而過(guò)高的覆蓋率會(huì)造成相鄰探針之間的雜交干擾。(2)支持介質(zhì)與雜交序列間的間隔序列長(zhǎng)度的影響。研究表明當(dāng)間隔序列長(zhǎng)度提高到15個(gè)寡核苷酸時(shí)雜交信號(hào)顯著增強(qiáng)。有研究表明,選擇合適長(zhǎng)度的間隔序列,可使雜交信號(hào)增強(qiáng)150倍。(3)雜交序列長(zhǎng)度的影響。在雜交反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生堿基錯(cuò)配現(xiàn)象,區(qū)分正常配對(duì)的互補(bǔ)復(fù)合物與單個(gè)或2個(gè)堿基的錯(cuò)配形成的復(fù)合物,主要依賴于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性不同,而雜交序列的長(zhǎng)度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素,一般說(shuō)來(lái),短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯(cuò)配,但復(fù)合物的穩(wěn)定性要差一些;而長(zhǎng)雜交序列形成的復(fù)合物穩(wěn)定,而區(qū)分堿基錯(cuò)配能力要差一些。研究表明,12、15、20個(gè)堿基產(chǎn)生的雜交信號(hào)強(qiáng)度接近,但15個(gè)堿基的雜交序列區(qū)分錯(cuò)配堿基效果最好。(4)GC含量的影響。GC含量不同的序列其復(fù)合物的穩(wěn)定性也不同。(5)探針濃度的影響。以凝膠為支持介質(zhì)的芯片,提高了寡核苷酸的濃度,在膠內(nèi)進(jìn)行的雜交更象在液相中進(jìn)行的雜交反應(yīng),這些因素提高了對(duì)錯(cuò)配堿基的分辨率,同時(shí)也提高了芯片檢測(cè)的靈敏度。(6)核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在使用凝膠作為支持介質(zhì)時(shí),單鏈核酸越長(zhǎng),則樣品進(jìn)入凝膠單元的時(shí)間越長(zhǎng),也就越容易形成鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響其與芯片上探針的雜交,因而樣品制備過(guò)程中,對(duì)核酸的片段化處理,不僅可提高雜交信號(hào)的強(qiáng)度,還可提高雜交速度。
6、雜交圖譜的信號(hào)檢測(cè)技術(shù)
雜交圖譜的信號(hào)檢測(cè)是生物芯片的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)之一,目前關(guān)于芯片的大量專利和研究集中在這方面。熒光檢測(cè)主要有2種:激光共聚焦熒光顯微掃描和CCD熒光顯微照相檢測(cè)。前者檢測(cè)靈敏度、分辨率均較高,但掃描時(shí)間長(zhǎng);后者掃描時(shí)間短,但靈敏度和分辨率不如前者。雖然熒光檢測(cè)在芯片技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用,但是熒光標(biāo)記的靶DNA只要結(jié)合到芯片上就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào),而目前的檢測(cè)系統(tǒng)還不能區(qū)分來(lái)自某一位點(diǎn)的熒光信號(hào)是由正常配對(duì)產(chǎn)生的,還是單個(gè)或2個(gè)堿基的錯(cuò)配產(chǎn)生的,或者兼而有之,甚或是由非特異性吸附產(chǎn)生的,因而目前的熒光檢測(cè)系統(tǒng)還有待于進(jìn)一步完善與發(fā)展。有研究者正試圖繞過(guò)熒光標(biāo)記,建立新的檢測(cè)系統(tǒng),以提高雜交信號(hào)檢測(cè)的靈敏度。
比較成熟的是采用激光系統(tǒng)掃描儀進(jìn)行的熒光檢測(cè),噪音水平、信噪比、分辨率是衡量掃描儀工作質(zhì)量的幾個(gè)重要指標(biāo)。由于熒光標(biāo)記法的靈敏度相對(duì)較低,因此質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測(cè)、乳膠凝集反應(yīng)、直接電荷變化檢測(cè)等等正作為新的芯片標(biāo)記和檢測(cè)方法處于研究和試驗(yàn)階段,其中最有前途的當(dāng)推質(zhì)譜法。
目前有很多廠商生產(chǎn)生物芯片信號(hào)檢測(cè)掃描儀,知名的公司包括:Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic aMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測(cè)系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品。2000年GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進(jìn)一步加強(qiáng)。
7、信號(hào)(信息)分析與解讀——數(shù)據(jù)分析
芯片雜交圖譜的多態(tài)性處理與存儲(chǔ)都由專門(mén)設(shè)計(jì)的軟件來(lái)完成。一個(gè)完整的生物芯片配套軟件應(yīng)包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理團(tuán)建、數(shù)據(jù)提?。?/span>mining)或統(tǒng)計(jì)分析軟件,芯片表達(dá)基因的國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析和積累。
從國(guó)際上生物芯片專利的按領(lǐng)域分布來(lái)看,62%的專利集中在數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域,可見(jiàn)如何對(duì)生物芯片帶來(lái)的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀、分析是生物芯片研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)和重點(diǎn)。
對(duì)所讀取的數(shù)據(jù)的處理方面,目前已經(jīng)有許多數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法用于芯片數(shù)據(jù)處理與信息提取,應(yīng)用最廣泛的是聚類(lèi)分析(cluster analysis)、此外還有主成分分析(principal component analysis)、時(shí)間序列分析(time series analysis)等,但是還沒(méi)有一種最標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)方式。
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