摘要: 本文建立了用于抗白念珠菌藥物快速篩選的濃度梯度微流控芯片平臺(tái)，通過(guò)熒光示蹤劑熒光素鈉在芯片上的分布定性考察濃度梯度生成情況，采用HPLC法對(duì)芯片內(nèi)模型藥物氟康唑的濃度梯度分布進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步比較不同流速條件對(duì)濃度梯度形成的影響，最終確定兩水相流速1:1的比例用于后續(xù)藥物篩選研究。以阿爾瑪藍(lán)為細(xì)胞活力指示劑，通過(guò)該平臺(tái)分別進(jìn)行了兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、特比萘芬、5-氟胞嘧啶、卡泊芬凈的藥敏實(shí)驗(yàn)，快速高效地獲得了藥物的MIC范圍，且與CLSI建議的白念珠菌敏感株的MIC值相一致，表明該平臺(tái)可以通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)快速篩選得到抗菌藥物的MIC值范圍。此外，該批次白念珠菌對(duì)特比萘芬呈現(xiàn)耐藥，與96孔板法驗(yàn)證結(jié)果一致，表明該方法還可以用于耐藥菌株的快速篩選。

隨著疾病譜和病菌譜的擴(kuò)展, 臨床上對(duì)抗真菌藥物(以白念珠菌為代表)的需求愈加迫切。白念珠菌(Candida albicans)是一種機(jī)會(huì)性致病真菌, 通常共生于健康個(gè)體中, 對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生侵害, 但偶爾會(huì)引起健康個(gè)體的黏膜(口腔/陰道)表面感染, 極少數(shù)情況下會(huì)引起皮膚或指甲的感染。但是, 在免疫功能低下的宿主中它可能引起危及生命的系統(tǒng)性和血液性感染, 死亡率高達(dá)50%, 它是嚴(yán)重真菌感染以及醫(yī)院感染的常見(jiàn)原因。臨床高發(fā)病率、致死率與耐藥率促使找尋新藥的腳步不斷加快。當(dāng)前對(duì)于抗白念珠菌藥物的篩選主要基于96孔板, 采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)建立的最新標(biāo)準(zhǔn)M27-A3中的微量液基稀釋法進(jìn)行。然而, 傳統(tǒng)孔板法需要配制不同濃度藥物溶液, 需要細(xì)胞鋪板、給藥、標(biāo)記等一系列繁雜費(fèi)時(shí)的操作過(guò)程, 所以亟需建立更快速的抗真菌藥物篩選新方法。

微流控芯片的通道尺度多是微米級(jí), 雷諾數(shù)很小, 液體處于層流狀態(tài), 兩種或多種不同試劑能夠保持各自流型不變流入同一通道, 只在相與相接觸面上發(fā)生分子擴(kuò)散或反應(yīng)?；趯恿鲾U(kuò)散和混合原理, 目前出現(xiàn)了很多濃度梯度微流控芯片, 這些芯片形成的濃度梯度具有較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 且通過(guò)改變通道構(gòu)型設(shè)計(jì)、流體進(jìn)樣流量比、初始濃度設(shè)置以及組合順序, 可以獲得一系列復(fù)雜的濃度梯度, 簡(jiǎn)化了繁雜的操作過(guò)程, 顯著減少了細(xì)胞和試劑消耗量, 同時(shí)可以進(jìn)行高通量篩選。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、模式生物趨化、基因分析、藥物篩選等研究領(lǐng)域。

課題組在前期研究中, 通過(guò)液滴微流控芯片所生成的液滴, 水相由單一成分組成, 一次實(shí)驗(yàn)通常只能考察一種實(shí)驗(yàn)條件, 為了提高藥物篩選的通量, 本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上, 在水相引入了濃度梯度生成器, 自行研制了一種濃度梯度液滴微流控芯片作為篩選平臺(tái), 以阿爾瑪藍(lán)作指示劑, 分別測(cè)試了氟康唑、兩性霉素B、特比萘芬等臨床常用抗真菌藥物的活性, 并采用孔板法驗(yàn)證該方法的可靠性與適用性。

材料與方法

菌株  白念珠菌SC5314菌株由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心提供。

儀器   微量推拉注射泵、四通道單推注射泵, 1倒置顯微鏡、體視鏡、Olympus DP73數(shù)碼彩色照相機(jī), ORCA-Flash 4.0 LT C11440-42U數(shù)字CMOS相機(jī), Kylin-Bell Vortex-5旋渦混合器, 愛(ài)國(guó)者數(shù)碼觀測(cè)王GE-5, HZ-2111K-B恒溫振蕩器, Infinite M 200多功能酶標(biāo)儀。

藥品與試劑  卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶、特比萘芬(純度均 > 98%), 氟康唑(≥98%)、兩性霉素B (80%)。SU-8 3025光刻膠, 硅單面拋光片和顯影液, SYLGARD?184 PDMS預(yù)聚體和固化劑, HFE-7500、Scotch隱形無(wú)痕膠帶, 全氟化聚醚-聚乙二醇嵌段高分子表面活性劑(PFPE-PEG block-copolymer surfactant, EA-surfactant) 。阿爾瑪藍(lán), 蛋白胨、瓊脂、酵母浸膏, 葡萄糖, NaOH、NaHCO3等無(wú)機(jī)鹽, 莧菜紅染料粉末。所有化學(xué)試劑除特殊說(shuō)明外均為分析純。

儲(chǔ)備液配制  阿爾瑪藍(lán)溶于純水中配制成10 mg·mL-1的儲(chǔ)備液, 4 ℃避光保存。氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶、特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑溶于DMSO中分別配制成3.2、0.8、0.8、6.4、3.2、3.2、3.2和3.2 mg·mL-1的母液, 儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

培養(yǎng)基配制  沙堡葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar, SDA)固體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、葡萄糖40.0 g、瓊脂18.0 g, 加入三蒸水900 mL溶解, pH值用NaOH調(diào)整至7.0, 三蒸水定容至1 L, 高溫高壓滅菌后在超凈臺(tái)內(nèi)倒出適量于培養(yǎng)皿中, 紫外照射待凝固后, 倒扣于超凈臺(tái)內(nèi)吹干上蓋的水珠后儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆?。酵母浸出粉胨葡萄?yeast extract peptone dextrose, YPD)培養(yǎng)基:酵母浸膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g, 三蒸水定容至1 L, 高溫高壓滅菌后分裝, 4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>

白念珠菌的培養(yǎng)  從-80 ℃凍存的菌株中挑取少許于YPD液體培養(yǎng)基中活化, 30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后, 吸取10 μL于新的1 mL YPD液體培養(yǎng)基中, 繼續(xù)在30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h, 用SDA固體培養(yǎng)基劃板, 30 ℃培養(yǎng)48 h, 待長(zhǎng)出大量單克隆菌落后, 4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)挑取SDA平板上的單克隆菌落于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中, 30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h, 使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

菌懸液制備  將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中離心去上清, 并用PBS緩沖液洗滌3次去除殘余培養(yǎng)基, 然后將細(xì)胞重懸于1640培養(yǎng)基, 計(jì)數(shù)后調(diào)整菌液至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

濃度梯度微流控芯片的設(shè)計(jì)與制作  采用AutoCAD 2015軟件進(jìn)行芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì), 芯片掩膜二維設(shè)計(jì)如圖 1。芯片含兩個(gè)水相入口、兩個(gè)油相入口、四個(gè)出口, 濃度梯度生成器采用經(jīng)典的“圣誕樹(shù)”結(jié)構(gòu), 其形成濃度梯度的機(jī)制是基于微通道的層流的擴(kuò)散混合效應(yīng), 芯片主通道寬設(shè)計(jì)為100 μm, 高為45 μm, 流體在通道內(nèi)呈現(xiàn)層流特性, 并在蛇形微通道內(nèi)發(fā)生快速混合與擴(kuò)散傳質(zhì)形成濃度梯度。T字形流動(dòng)聚集處寬為20 μm。芯片采用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)制作而成。

濃度梯度表征  為了驗(yàn)證芯片是否形成了濃度梯度并找到通入溶液的最佳流速, 采用染料熒光素鈉和莧菜紅對(duì)芯片的藥物濃度梯度進(jìn)行定性表征, 并通過(guò)HPLC對(duì)藥物濃度定量從而對(duì)芯片的藥物濃度梯度進(jìn)行定量表征。

染料定性表征濃度梯度  選用50 mg·mL-1莧菜紅溶液和20 μg·mL-1的熒光素鈉水溶液作兩種水相, 結(jié)合課題組前期對(duì)液滴微流控芯片研究成果[22]與該芯片系統(tǒng)使用條件的考察, 水相流速在80~120 μL·h-1時(shí)能夠形成尺寸均一、大小適宜的液滴。因此, 實(shí)驗(yàn)考察兩水相流速分別為100/80、100/100、100/120 μL·h-1的條件下, 芯片濃度梯度形成情況以及液滴生成形態(tài), 并通過(guò)熒光顯微鏡采集通道內(nèi)熒光圖像。

HPLC定量表征濃度梯度  選用氟康唑進(jìn)行芯片藥物濃度梯度定量表征, 參考2015版中國(guó)藥典中氟康唑注射液的定量方法進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件   色譜柱為Inertsil ODS-3 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)的色譜柱; 柱溫40 ℃; 紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm; 流動(dòng)相為乙腈-0.063%甲酸銨水溶液(20:80);進(jìn)樣量20 μL。

儲(chǔ)備液和工作液配制  精密稱取氟康唑?qū)φ掌?/span>4.20 mg, 用流動(dòng)相溶解定容至20 mL, 配制成濃度為210 μg·mL-1的溶液作為母液, 用流動(dòng)相稀釋至濃度為100、50、25、10、5和1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。

為了考察氟康唑藥物在芯片內(nèi)的四種濃度梯度生成情況, 將油相入口封堵, 水相則以空白流動(dòng)相作為A相, 100 μg·mL-1工作溶液作為B相, A:B相流速比分別為1:2、1:1和2:1進(jìn)樣生成濃度梯度, 濃度梯度生成后直接在出口處收集30 min水相溶液, 將收集的溶液進(jìn)行HPLC定量。

濃度梯度微流控芯片的系統(tǒng)考察   在芯片應(yīng)用前, 對(duì)芯片系統(tǒng)的適用條件和液滴穩(wěn)定性進(jìn)行考察。根據(jù)課題組前期研究選用HFE-7500作為油相, 考察不同水相流速(40~100 μL·h-1)、油相流速(40~200 μL·h-1)以及流速比(1:1、1:2)下液滴生成情況, 以在較短時(shí)間內(nèi)生成穩(wěn)定且大小均一適中的液滴。將生成的液滴收集至離心管中, 從收集當(dāng)天(0天)至第5天每天將其涂布于載玻片上觀察其形態(tài)和尺寸以考察其穩(wěn)定性。

液滴包裹白念珠菌考察  活死染色是一種常用的細(xì)胞標(biāo)記的方法, 通過(guò)對(duì)液滴內(nèi)的白念珠菌染色可以觀察液滴內(nèi)白念珠菌的分布情況。

兩水相分別為菌液相和空白水相。菌液相按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)用RPMI 1640培養(yǎng)基配制100 μL含活死染料的白念珠菌溶液(菌濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1)、空白水相為RPMI 1640溶液(無(wú)菌), 在水相流速為100 μL·h-1、油相流速為200 μL·h-1條件下, 生成濃度梯度并包裹形成液滴。

濃度梯度微流控芯片實(shí)驗(yàn)  分別配制含藥水相溶液100 μL和含菌液水相溶液100 μL, 其中含藥水相溶液包含藥液、阿爾瑪藍(lán)(終濃度250 μg·mL-1), 含菌液水相溶液包含白念珠菌(終濃度0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1)、阿爾瑪藍(lán)(終濃度250 μg·mL-1)。根據(jù)CLSI的M27-A3, 各待測(cè)藥物的起始濃度分別為:氟康唑64 μg·mL-1、兩性霉素B 16 μg·mL-1、卡泊芬凈8 μg·mL-1、5-氟胞嘧啶64 μg·mL-1、特比萘芬32 μg·mL-1、伊曲康唑32 μg·mL-1、伏立康唑32 μg·mL-1、泊沙康唑32 μg·mL-1。設(shè)定無(wú)藥陽(yáng)性對(duì)照組(含菌)和空白對(duì)照組(無(wú)菌)。油相為HFE-7500 (含1% EA-surfactant)。用微量注射泵以100 μL·h-1的流速向芯片水相入口1引入抗白念珠菌藥物、水相入口2引入白念珠菌, 以200 μL·h-1的流速向兩油相入口引入油相, 采用多濃度梯度微流控芯片生成液滴后收集到滅菌的0.2 mL離心管內(nèi), 于30 ℃條件下孵育2 h, 取少量液滴涂布于載玻片顯微鏡下觀察熒光情況。

孔板實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證  分別以兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、特比萘芬、5-氟胞嘧啶、卡泊芬凈為試藥進(jìn)行十級(jí)倍比稀釋, 在96孔板中進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn), 采用直接觀察法判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。氟康唑的濃度為64~0.13 μg·mL-1, 伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和特比萘芬的給藥濃度為32~0.063 μg·mL-1, 兩性霉素B的濃度為: 16~0.031 μg·mL-1, 5-氟胞嘧啶的給藥濃度為8~0.016 μg·mL-1, 卡泊芬凈的濃度為0.8~0.007 8 μg·mL-1, 菌的終濃度為(0.5~2.5)×103 CFU·mL-1。每種試藥設(shè)兩個(gè)復(fù)孔, 用于平行對(duì)照, 30 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后將孔板對(duì)光從孔板底部觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 以孔內(nèi)產(chǎn)生渾濁的前一個(gè)孔的濃度為MIC。

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