細(xì)胞捕獲分離是免疫學(xué)、診斷檢測、病理研究等學(xué)科經(jīng)常用到的生物學(xué)實驗方法．近年來，微流控芯片平臺的細(xì)胞捕獲分離方式花樣繁多，層出不窮，它具有可快速檢測、所需樣本量少、節(jié)約試劑、成本低廉等優(yōu)勢。微流控細(xì)胞捕獲分離的方法，以免疫捕獲分離和無標(biāo)簽細(xì)胞分離兩類對其進(jìn)行介紹．免疫捕獲分離是較為傳統(tǒng)的細(xì)胞捕獲分離方式，它的特異性好、捕獲分離后的細(xì)胞純度較高．無標(biāo)簽細(xì)胞分離是近幾年熱門發(fā)展的技術(shù)手段，它采用物理學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合的方式，能較好地保持細(xì)胞的完整性和生物活性。

細(xì)胞捕獲分離是指把在液體中的多種混合細(xì)胞通過物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等手段，從液體中分離出一種或幾種細(xì)胞的過程．細(xì)胞捕獲分離作為生物學(xué)、醫(yī)療診斷、毒理監(jiān)測等方面的重要實驗內(nèi)容，一直是實驗室研究的一個熱點(diǎn)．細(xì)胞捕獲分離后可用于細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫及細(xì)胞周期狀態(tài)觀測等后續(xù)實驗，是一種必不可少的實驗手段．

細(xì)胞計數(shù)與細(xì)胞捕獲分離的區(qū)分并不明確，細(xì)胞計數(shù)常會用到細(xì)胞捕獲分離作為前置手段，但很多細(xì)胞計數(shù)的手段和方法并不能適用于細(xì)胞捕獲分離．細(xì)胞計數(shù)只要求得到規(guī)定樣品中目的細(xì)胞數(shù)，可以通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]或在混合樣品中直接針對特定細(xì)胞的電容、電阻進(jìn)行測定[2]，并不一定要對目的細(xì)胞進(jìn)行捕獲分離．而細(xì)胞分離則需要從樣本中有針對性地分離出所需細(xì)胞，往往對收集后的細(xì)胞還有較高的要求，需要保持細(xì)胞原有的形態(tài)，甚至一些實驗還要求細(xì)胞生長狀態(tài)正常，以便對其進(jìn)一步地觀察和研究．這就大大限制了細(xì)胞分離的方法，提高了難度．

細(xì)胞計數(shù)主要包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞計數(shù)．白細(xì)胞計數(shù)(包括CD3+/CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)等[3])常用于檢測炎癥反應(yīng)、人體免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)感染[4]、寄生蟲感染等與人體免疫相關(guān)的疾病[5]，其數(shù)值的升高和降低都會對體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生巨大影響，常作為人體健康狀況的重要參照指標(biāo)．紅細(xì)胞計數(shù)作為血常規(guī)的一個檢測指標(biāo)，常用于貧血、白血病等病癥的檢測．另外，近年來針對癌癥相關(guān)研究的不斷突破，計數(shù)檢測外周血中痕量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)也成為了癌癥診斷的一個生物標(biāo)志物，可以檢測癌細(xì)胞的遷移[6]．除細(xì)胞計數(shù)外，生物科學(xué)和醫(yī)療診斷的前期實驗也常需要細(xì)胞分離技術(shù)，為后續(xù)如藥物刺激、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗研究做準(zhǔn)備．

目前細(xì)胞分離的手段多種多樣，如流式細(xì)胞分離、蔗糖密度梯度離心細(xì)胞分離、介電電泳分離[7]等。

微流控芯片技術(shù)是指把生物學(xué)、化學(xué)等實驗的基本操作過程集成到一塊芯片上，其芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)中至少有一維為微米甚至納米尺度規(guī)格結(jié)構(gòu)，可以自動完成實驗及分析的全過程．由于微流控芯片具有集成性、高通量、檢測快速、操作便利、所需樣本量少、低耗能、低成本等優(yōu)點(diǎn)，近年來其在藥物篩選、環(huán)境檢測、司法檢測、臨床診斷和生物醫(yī)藥研究等眾多科研與生活領(lǐng)域擁有越來越廣闊的應(yīng)用前景[2]．

微流控芯片主要是在微米尺度下操控的流通技術(shù)，但是與傳統(tǒng)的流通技術(shù)相比，微流控系統(tǒng)一個最重要特征就是微型化，而且同時要考慮便于攜帶和檢測，微流控芯片在精細(xì)結(jié)構(gòu)上要比流體技術(shù)更為復(fù)雜．微流控芯片的主要構(gòu)成部分根據(jù)不同的實驗?zāi)康呐c需求會有很大的不同，有關(guān)細(xì)胞捕獲分離的微流控芯片，大多包括進(jìn)樣管路、細(xì)胞捕獲或分離區(qū)域、廢液收集區(qū)和反應(yīng)檢測區(qū)幾部分(圖1)．進(jìn)樣管路和廢液收集區(qū)域?qū)儆诨緲?gòu)造，大部分微流控芯片的構(gòu)造也基本相近，并非是影響實驗和微流控芯片的關(guān)鍵部分．而微流控芯片主要的功能區(qū)在于捕獲分離區(qū)和反應(yīng)檢測區(qū)，這兩部分也是不同微流控芯片的關(guān)鍵和特色區(qū)域．在捕獲分離區(qū)主要是根據(jù)細(xì)胞的大小形態(tài)等物理特性對目的細(xì)胞進(jìn)行分離攔截或特異性結(jié)合捕獲目的細(xì)胞．在反應(yīng)檢測區(qū)域，應(yīng)用光學(xué)傳感器是一類較為廣泛的檢測方法，此外還有表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，SPR)、波導(dǎo)管、熒光、單細(xì)胞表征分析和化學(xué)發(fā)光等檢測方法[8]．

圖1微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖

微流控芯片細(xì)胞捕獲分離主要方法

常見的微流控芯片細(xì)胞捕獲分離方法有磁珠捕獲分離[9-10]、微矩陣捕獲、微液滴分選[11-12]、聲波分離等方法，按最終捕獲分離細(xì)胞的狀態(tài)可分為免疫捕獲細(xì)胞分離和無標(biāo)簽細(xì)胞分離兩種(表1)．

免疫捕獲細(xì)胞分離的方法目前在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較廣，該類方法主要根據(jù)抗體可以特異性結(jié)合目的細(xì)胞表面抗原，借此分離目的細(xì)胞．其優(yōu)點(diǎn)在于可以特異性地捕獲目的細(xì)胞，所得到的細(xì)胞純度較高，也是目前普遍使用的細(xì)胞捕獲、計數(shù)方法．其缺點(diǎn)在于捕獲分離后的細(xì)胞表面多帶有捕獲抗體甚至其他標(biāo)記熒光、微珠等，不利于后續(xù)細(xì)胞的培養(yǎng)和狀態(tài)性質(zhì)的進(jìn)一步觀察研究，多用于細(xì)胞計數(shù)等檢測手段．

抗體特異性細(xì)胞捕獲是生物學(xué)上最常用到的捕獲方法，通過細(xì)胞表面的抗原與特異性抗體結(jié)合，固定抗體以捕獲細(xì)胞．對于抗體特異性捕獲細(xì)胞，抗體相對于捕獲細(xì)胞靶點(diǎn)的親和性是十分重要的．但是由于一個完整細(xì)胞要比抗原、抗體大很多，用一個或幾個抗原-抗體相結(jié)合很難抓住一個細(xì)胞，所以在抗體特異性細(xì)胞捕獲中，往往需要控制流速、采用多個結(jié)合點(diǎn)多次攔截捕獲細(xì)胞的方法[13-14]，加大細(xì)胞被捕獲的幾率(圖2a)．

磁珠細(xì)胞分離：磁珠標(biāo)記抗體特異性結(jié)合目的細(xì)胞，再通過磁力分離目的細(xì)胞，是實驗中經(jīng)常會用到的方法．磁珠捕獲細(xì)胞分離的方法應(yīng)用范圍廣泛，只要有可以與目的細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體就可以有針對性地捕獲細(xì)胞．而且大多數(shù)情況下，磁珠捕獲細(xì)胞的特異性很高，但是磁珠的大小、抗體對細(xì)胞表面抗原的親和性強(qiáng)弱以及細(xì)胞所在緩沖液的黏稠度等因素對于目的細(xì)胞捕獲效率影響很大，尤其在細(xì)胞環(huán)境較復(fù)雜(如全血條件)時磁珠的捕獲效率較低．

表面張力不相容過濾篩選/非混相屏障細(xì)胞篩選：表面張力不相容過濾篩選(immisciblefiltrationassistedbysurfacetension，IFAST)是通過微尺寸物理現(xiàn)象建立的不相容液體流向壁壘(非混相屏障)[18]，不相容液相界面間具有較高的能量，形成一道屏障，可以阻止不想要的細(xì)胞或其他雜質(zhì)通過．Scott及其實驗室利用IFAST方法從混合型的基質(zhì)細(xì)胞、熒光、全血中特異性分離乳腺癌細(xì)胞，效率大約為70%，純度＞80%，還可以通過多級非混相屏障提高分離純度．該方法符合微流控芯片操作特點(diǎn)，成本低廉、操作簡便、反應(yīng)快速，而且不需要洗去多余成分步驟，降低了洗滌步驟帶來的不確定性，但利用IFAST方法分離，在進(jìn)樣腔內(nèi)需要事先用磁珠捕獲目的細(xì)胞，再利用磁鐵把目的細(xì)胞從非混相腔吸出到收集腔(圖2c)，細(xì)胞結(jié)合磁珠可能對細(xì)胞的后續(xù)操作會有影響，如果可以尋找方法從非混相腔中直接獲得目的細(xì)胞，利用范圍會更廣．

圖2免疫捕獲細(xì)胞分離芯片結(jié)構(gòu)示意圖(a)抗體特異性細(xì)胞捕獲示意圖．(b)磁珠細(xì)胞分離芯片示意圖．(c)表面張力不相容過濾篩選芯片示意圖．

無標(biāo)簽細(xì)胞分離大多采用物理學(xué)中流體力學(xué)、慣性力等方法[19-20]，根據(jù)細(xì)胞自身物理形態(tài)或利用黏附分子等對細(xì)胞表面施加瞬間作用力，使不同細(xì)胞在微流控通道所受外力不同，從而達(dá)到細(xì)胞分離的目的．無標(biāo)簽細(xì)胞分離方法優(yōu)勢在于分離出的細(xì)胞表面無任何其他修飾，可以繼續(xù)培養(yǎng)及觀察細(xì)胞理化性質(zhì)．但無標(biāo)簽細(xì)胞分離由于是通過物理分離法，得到目的細(xì)胞常常純度不高，其中混雜有其他雜質(zhì)或非目的細(xì)胞．

小孔徑攔截細(xì)胞分離：由于不同細(xì)胞在大小、形態(tài)、剛性、透光度等方面都會有所差別，借由物理方法可以對細(xì)胞進(jìn)行分離．目前所用物理方法分離細(xì)胞的手段也越來越多樣化，最基本的是根據(jù)細(xì)胞大小和外形差異，直接進(jìn)行分離．

非對稱流系統(tǒng)細(xì)胞分離：非對稱流分離系統(tǒng)(asymmetricalflowfield-flowfractionation，AFF)是通過不對稱分子模式的瞬間作用力，在物理方面廣泛運(yùn)用的側(cè)向位移，同時延長了分子特異性標(biāo)簽的長度，可以有效地從全血的持續(xù)液流中分離出白細(xì)胞．相對于垂直作用力的細(xì)胞連續(xù)分離方式(如電泳法、聲波法、引力作用、慣性作用、外磁場力等)，非對稱流分離系統(tǒng)通過黏附分子對細(xì)胞施加瞬間不對稱作用力，偏轉(zhuǎn)流動過程中細(xì)胞的垂直方向作用力，不需要捕獲而達(dá)到細(xì)胞分離效果．這種微流控芯片的滾動附著力是通過在微流控通道中修飾一層黏附分子P選擇素，施力作用于淋巴細(xì)胞表達(dá)的P選擇素糖蛋白配體1(P-selectinglycoproteinligand-1，PSGL-1)，使淋巴細(xì)胞滾動方向發(fā)生偏移(圖3b)[24]．這種微流控芯片可以分離復(fù)雜環(huán)境中的目的細(xì)胞，細(xì)胞不需要標(biāo)記標(biāo)簽，避免不可逆的細(xì)胞捕獲，分離后細(xì)胞有較高的存活率及功能完整性。

聲波細(xì)胞分離是在芯片微通道兩側(cè)，通過聲波對細(xì)胞施加外力，由于細(xì)胞的大小、質(zhì)量、密度等物理性質(zhì)不同，所受聲波力不同，使細(xì)胞在微通道中偏轉(zhuǎn)角度改變，不同種細(xì)胞會流成幾股液流，在不同方向收集，以達(dá)到細(xì)胞分離目的．為了區(qū)分一些物理狀態(tài)相似細(xì)胞，也可以特異性標(biāo)記一些微珠在目的細(xì)胞表面，以此改變細(xì)胞的物理特性，而更好地分離出目的細(xì)胞．

微液滴細(xì)胞分離/熒光激活細(xì)胞分選：流式細(xì)胞術(shù)是細(xì)胞計數(shù)、分選及性質(zhì)分析中常用到的手段，微液滴細(xì)胞分離所用原理與其類似，但簡化了流式細(xì)胞儀的復(fù)雜構(gòu)造．微液滴細(xì)胞分選整合了熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activatedcellsorting，F(xiàn)ACS)[30]和微液滴芯片技術(shù)[31]，從單向微流控芯片技術(shù)改為T型結(jié)構(gòu)或流動匯聚型結(jié)構(gòu)，樣品被鞘液包裹形成小液滴，目的細(xì)胞標(biāo)識熒光染料后通過檢測器[32]，激光激活染料熒光再利用光信號收集所要的目的細(xì)胞．微液滴細(xì)胞分離的精確度和純度都較其他微流控芯片方法更好，但芯片所需配套設(shè)備復(fù)雜，而且并不適合如全血等復(fù)雜環(huán)境下的細(xì)胞分離．

多路復(fù)用螺旋微流控芯片細(xì)胞分離：螺旋微流控芯片分離細(xì)胞是利用曲線微通道中迪恩旋渦流動力原理，較大的CTCs在通道中的慣性上升力與內(nèi)壁作用力相抵消在螺旋通道內(nèi)壁流動，而血液中其他較小的物質(zhì)則靠近外壁一側(cè)流動(圖3e)，可以借此利用迪恩渦心力實現(xiàn)CTCs從全血中的分離。

圖3無標(biāo)簽細(xì)胞分離方法芯片結(jié)構(gòu)示意圖(a)小孔徑攔截酯膜電鏡圖．(b)非對稱流系統(tǒng)細(xì)胞分離示意圖．(c)斜角表面聲波技術(shù)細(xì)胞分離．(d)微液滴細(xì)胞分選．(e)多路復(fù)用螺旋微流控芯片細(xì)胞分離示意圖．

細(xì)胞捕獲分離一直是免疫學(xué)、診斷檢測、病理研究等學(xué)科經(jīng)常用到的生物學(xué)實驗方法．微流控芯片的主要優(yōu)勢在于：a．上樣體積小，節(jié)約原料、試劑與樣本；b．檢測結(jié)果單個周期短，可以實現(xiàn)快速測量，節(jié)約時間；c．適用于高通量檢測或宏觀尺度無法實現(xiàn)的實驗操作，具有低成本、高效快速的特點(diǎn)，在細(xì)胞分離過程中更易做到微觀操控、精準(zhǔn)分析．

在微流控芯片中，通過抗體捕獲、熒光標(biāo)記等標(biāo)簽標(biāo)記目的細(xì)胞后，多數(shù)情況下會對細(xì)胞本身產(chǎn)生一定的影響，大多只能用于捕獲分離后的細(xì)胞計數(shù)．無標(biāo)簽細(xì)胞分離多數(shù)是通過物理方法，利用微流控芯片的流體力學(xué)原理，從細(xì)胞大小、尺寸等方面實現(xiàn)細(xì)胞分離．無標(biāo)簽細(xì)胞分離優(yōu)勢在于分離后的細(xì)胞既可用于細(xì)胞計數(shù)，也可用于細(xì)胞理化性質(zhì)觀察、細(xì)胞增殖培養(yǎng)等后續(xù)實驗，也是目前細(xì)胞分離方法的主要發(fā)展方向，但相對于標(biāo)簽捕獲分離的方法，在純度和特異性上還需要提高．今后微流控芯片在細(xì)胞捕獲方面可能更傾向于非標(biāo)簽方式的捕獲分離，結(jié)合物理學(xué)與生物學(xué)的方法，根據(jù)所做實驗的需要，在捕獲效率與純度方面更好協(xié)調(diào)，高效方便快捷地實現(xiàn)細(xì)胞分離的目的．

用于細(xì)胞捕獲分離的微流控芯片需根據(jù)實驗要求選擇合適材料，如果要進(jìn)一步培養(yǎng)觀察分離出的細(xì)胞，還要確定細(xì)胞所在芯片環(huán)境是否無菌無毒，是否利于細(xì)胞存活生長．微流控芯片材料一般有聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)、聚苯乙烯(polystyrene，PS)、玻璃、硅片等．
其中PDMS應(yīng)用最為廣泛，尤其在細(xì)胞捕獲分離實驗中，PDMS具有較好的生物相容性和一定的透氣性，更有利于實驗中細(xì)胞的生長存活及性質(zhì)分析，但芯片微結(jié)構(gòu)易變形，所以較難應(yīng)用于商業(yè)化大批量生產(chǎn)，而更適用于科研過程中芯片結(jié)構(gòu)及實驗效果摸索．PMMA隨著材料及切割技術(shù)的發(fā)展越來越普及，在微流控芯片的實驗室發(fā)展過程中逐漸得到了廣泛應(yīng)用．相信隨著微流控芯片技術(shù)和材料科學(xué)的不斷進(jìn)步，更多適用于實驗要求的材料也會不斷為芯片的制作及商業(yè)化生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的推動，促進(jìn)微流控芯片技術(shù)更快更好地發(fā)展。

微流控芯片目前的發(fā)展策略主要有兩個方向：一類是利用微流控芯片高通量、上樣量小等優(yōu)勢，在科研過程中使用，解決一些在宏觀層面不易達(dá)成的實驗問題，這類芯片并不一定要求最終結(jié)果直接在芯片中顯示出來，而是作為一個高精密度的反應(yīng)容器，最后可利用實驗室內(nèi)的其他儀器配合實驗，分析結(jié)果．另一類是以商品形式面向普通群眾為主要目的芯片，這類芯片往往需要有高度整合性，同時配備微型化的檢測及數(shù)據(jù)處理裝置，具有可手持診斷、價格適中、方便操作等優(yōu)點(diǎn)，使用者只需做簡單加樣就可由儀器經(jīng)過暗箱處理后直接得到最終結(jié)果，體現(xiàn)了微流控芯片小型、簡便、快速測定的優(yōu)勢．微流控芯片在細(xì)胞捕獲分離方面，目前主要集中于實驗室層面，配合其他儀器使用，而后一類高度集成的微流控芯片還相對較少，且實現(xiàn)難度遠(yuǎn)高于前一種形式．但相信隨著微流控技術(shù)和構(gòu)造方法的進(jìn)一步發(fā)展，細(xì)胞捕獲分離技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新，基于微流控芯片的細(xì)胞捕獲、分離將在科學(xué)研究和臨床診斷中逐漸得到廣泛應(yīng)用，為提升人類健康水平做出貢獻(xiàn)．

免責(zé)聲明：文章來源《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》DOI: 10.16476/j.pibb.2016.0147 作者：董盛華 張晶 葛勝祥   以傳播知識、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除。