秀麗隱桿線蟲(chóng)通常縮寫(xiě)為  線蟲(chóng)， 是一種非寄生線蟲(chóng)，由于其特殊的屬性，它被廣泛用作生物學(xué)中的模式生物。線蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)一直是科研工作者調(diào)查的主題，因?yàn)樗亲詈?jiǎn)單的有機(jī)體之一。這種興趣使  秀麗隱桿線蟲(chóng)  成為第一個(gè)將其全基因組測(cè)序的多細(xì)胞生物體。這些特點(diǎn)使  C. elegans  成為生物學(xué)家在活細(xì)胞成像領(lǐng)域的選擇。

為了實(shí)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲(chóng)的高分辨率，活細(xì)胞視頻和圖像而實(shí)現(xiàn)的最重要的先決條件 是動(dòng)物的固定化。事實(shí)上，偶然運(yùn)動(dòng)可能會(huì)引起文失焦圖像，使整個(gè)觀察無(wú)用。固定化方法可以分為兩種通用方法：化學(xué)技術(shù)和物理技術(shù)。

第一類包括通過(guò)任何化學(xué)化合物（如金屬離子或抗體）實(shí)現(xiàn)固定的所有方法。雖然這些技術(shù)可以在固定化方面提供良好的結(jié)果，但它們中的大多數(shù)似乎對(duì)細(xì)胞有不利影響，即使使用非常低的濃度。另一方面，物理技術(shù)通常取決于介質(zhì)的粘度通過(guò)捕捉和保持蝸桿的某些方式或一些手段來(lái)改變。在Aufderheide（2008）中可以找到更詳細(xì)和詳盡的這些方法的綜述。

關(guān)于  秀麗隱桿線蟲(chóng)，在文獻(xiàn)中蠕蟲(chóng)固定的最常用技術(shù)依賴于使用膠水或麻醉藥物。雖然這些方法已經(jīng)很成熟，但它們可能會(huì)影響樣本誘導(dǎo)生理變化或阻止未來(lái)的操作。此外，它們是低通量技術(shù)，因?yàn)橛眠@些方法固定大量線蟲(chóng)相當(dāng)困難和耗時(shí)。即使使用更新和更復(fù)雜的手段來(lái)獲得  線蟲(chóng) 固定化，如聚苯乙烯納米粒子（Kim  et al。，2013），而設(shè)置起來(lái)更容易有缺陷。最嚴(yán)重的缺點(diǎn)是，固定化依賴于蠕蟲(chóng)生長(zhǎng)階段，因此需要預(yù)測(cè)蠕蟲(chóng)的種群。

微流控技術(shù) 可以解決與線蟲(chóng)研究有關(guān)的固定化和其他問(wèn)題 ，因?yàn)樗粌H可以控制流體流動(dòng)和藥物輸送  到樣本，還可以為動(dòng)物易于操作和處理提供平臺(tái)。此外，避免使用膠水和麻醉劑進(jìn)行需要蠕蟲(chóng)固定的研究。

近年來(lái)，為了獲得片上蠕蟲(chóng)固定，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多微流控中的方法和裝置。最顯著的是通過(guò)冷卻（K. Chung  et al。，2008），壓縮或限制（TV Chokshi  等人，2009; SE Hulme  等人，2007），CO2（TV Chokshi  等人，2009）和周圍流體的凝膠化（J.Krajniak和Lu，2010）。

1.微流控溫度誘導(dǎo) 秀麗隱桿線蟲(chóng)的固定

Kwanghun Chung（K. Chung 等，2008）開(kāi)發(fā)的這種方法  解決了體內(nèi)  顯微鏡，表型和篩選的關(guān)鍵挑戰(zhàn)  ，即具有能夠以與標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)兼容的方式處理蠕蟲(chóng)的硬件，并且允許自動(dòng)化觀察和操作樣品。在這項(xiàng)技術(shù)中，它采用了 內(nèi)置閥門(mén)的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片控制線蟲(chóng)的懸浮。該設(shè)備的關(guān)鍵特征在于集成了幾項(xiàng)關(guān)鍵設(shè)計(jì)特性，確保實(shí)驗(yàn)具有高通量。另外，可以采用一種算法來(lái)自動(dòng)完成圖像采集，分析和分類的整個(gè)過(guò)程，從而使系統(tǒng)無(wú)需人工干預(yù)即可運(yùn)行。Chung的方案依靠4個(gè)步驟（圖1）：蠕蟲(chóng)首先通過(guò)恒定的壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)（恒壓泵）加載到微流體裝置中，然后通過(guò)冷卻可逆地固定樣品，并由高分辨率顯微鏡掃描。隨后，進(jìn)行表型分型并將獲得的視頻/圖像存儲(chǔ)用于進(jìn)一步分析。

所述微流控芯片  是通過(guò)常規(guī)的軟光刻方法制造。它由兩層組成，一個(gè)用于流量調(diào)節(jié)，一個(gè)用于溫度控制，由一個(gè)20μm厚的PDMS膜分開(kāi)（圖2）。這些層通過(guò)等離子體處理結(jié)合在一起并覆蓋玻璃板。微流體裝置的特征在于六個(gè)顯著特征：

圖2

1.  內(nèi)置系統(tǒng)可自動(dòng)調(diào)節(jié)芯片內(nèi)的線蟲(chóng)負(fù)載，確保成像室內(nèi)一次只有一個(gè)蠕蟲(chóng)。

2.  一個(gè)定位系統(tǒng)，可以高精度地將每只動(dòng)物放置在同一個(gè)位置。

3.  溫度控制系統(tǒng)，其提供所需的樣品的固定的冷卻。

4.  裝置與任何標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡設(shè)備完全兼容。

5.  低成本和相對(duì)容易的制造。

6.  高吞吐量和分揀效率。

為了將蠕蟲(chóng)加載到芯片中，兩個(gè)出口通道都關(guān)閉，而側(cè)面定位通道保持打開(kāi)。然后通過(guò)恒壓泵將流體驅(qū)入通道。此外，加載調(diào)節(jié)器系統(tǒng)確保一次只有一個(gè)蠕蟲(chóng)在指定用于成像的芯片區(qū)域中。這是可能的，因?yàn)楫?dāng)動(dòng)物存在于成像室中時(shí)，室的流動(dòng)阻力增加。流量壓力 - 降低位于成像室入口處的樣品加載調(diào)節(jié)器上的第二只動(dòng)物的壓力。因此，這種壓降使系統(tǒng)無(wú)法將第二個(gè)蝸桿推入其中。然后，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)蠕蟲(chóng)被釋放時(shí)，這個(gè)限制被解除，并且壓力回升到系統(tǒng)能夠推動(dòng)連續(xù)蠕蟲(chóng)內(nèi)部的點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)成像室內(nèi)精確和可重現(xiàn)的定位，利用定位通道與主通道入口之間的壓力差。事實(shí)上，一旦動(dòng)物定位在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，定位通道的流體動(dòng)力學(xué)阻力就自動(dòng)均衡，并且因此壓力均勻地分布在蝸桿的主體上，防止對(duì)動(dòng)物造成過(guò)高的機(jī)械壓力。該系統(tǒng)的高精度放置功能可以最大限度地減少顯微鏡電動(dòng)載物臺(tái)的移動(dòng)距離，從而確定蠕蟲(chóng)的位置，從而使整個(gè)過(guò)程更加省時(shí)。一旦放入成像區(qū)域，線蟲(chóng)被冷卻至?4°C以固定它們。該程序不使用任何麻醉劑，因此不會(huì)因藥物使用而對(duì)樣品產(chǎn)生任何潛在的副作用。此外，已被證明與疊氮化鈉固定效果相同。最后，使用微流控技術(shù)可以使該設(shè)置輕松便宜地進(jìn)行復(fù)制，并與任何標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡設(shè)置完全兼容。

2.  線蟲(chóng) 在微流控芯片上的二氧化碳固定化

TVChokshi  等。 （2009）開(kāi)發(fā)了一種線蟲(chóng) 技術(shù) 它利用微流體芯片的優(yōu)勢(shì)，內(nèi)置固定室，蝸桿通過(guò)創(chuàng)建CO2微環(huán)境而被捕獲。事實(shí)上，二氧化碳能夠長(zhǎng)時(shí)間抑制線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)（長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)），而不會(huì)對(duì)蠕蟲(chóng)造成任何永久性損害，確實(shí)在固定后可以恢復(fù)幾秒鐘。此外，這種方法已被證明適用于不同年齡組的蠕蟲(chóng)（L4）。使用的裝置是一個(gè)雙層PDMS微流控芯片（圖3）：一層稱為“行為”模塊，被固定化后的動(dòng)物恢復(fù)活力，另一層為蠕蟲(chóng)被固定的位置，因此被命名為固定化模塊。行為模塊由一個(gè)鋸狀微通道組成，這個(gè)通道迫使蠕蟲(chóng)以正弦形式移動(dòng)，以便進(jìn)一步分析它的運(yùn)動(dòng)。固定層含有產(chǎn)生二氧化碳微環(huán)境的腔室以固定蝸桿，從而可以進(jìn)行成像。最后，這兩層由30微米厚的隔離層PDMS膜。二氧化碳微環(huán)境是通過(guò)使純二氧化碳通過(guò)控制層并通過(guò)膜擴(kuò)散進(jìn)入流動(dòng)層而獲得的。眾所周知，PDMS對(duì)非極性氣體具有高度滲透性，因此二氧化碳能夠快速替換固定室中的空氣。此外，隔膜足夠厚以能夠維持氣體壓力（10psi）而沒(méi)有明顯的偏轉(zhuǎn)。

圖3

蠕蟲(chóng)被裝入芯片的主要流動(dòng)通道并通過(guò)激活集成的微流體閥來(lái)操縱（圖3中的閥門(mén)1,2和3）通過(guò)控制通道。垂直于主加載通道的單獨(dú)通道（“位置”通道）用于將蠕蟲(chóng)定位在行為模塊和固定模塊內(nèi)。為了防止蝸桿進(jìn)入位置通道，一些PDMS支柱（圖3，II）在與裝載通道的交叉處制造。這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的固定（長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)），從而允許更長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行顯微鏡觀察。此外，固定室內(nèi)氧氣的缺乏減少了熒光標(biāo)記物的光漂白，使得CO 2方法對(duì)于長(zhǎng)期熒光成像實(shí)驗(yàn)（例如細(xì)胞發(fā)育的延時(shí)成像）特別有吸引力。

3. 用于 線蟲(chóng) 誘捕的微流控陣列夾具

S. Elizabeth Hulme  et al。 （2007）設(shè)計(jì)了一種微流體裝置，能夠 一次性機(jī)械地捕捉大（> 100）數(shù)量的  線蟲(chóng)。該程序依賴于在楔形通道（圖4）的微流體芯片或“夾子”中的實(shí)施，其能夠捕獲蠕蟲(chóng)并由此物理地抑制其運(yùn)動(dòng)。具體而言，微通道的寬度逐漸變窄，從100μm降至10μm，長(zhǎng)度為5mm（圖4）

圖4

該裝置本身由一個(gè)分配通道網(wǎng)絡(luò)組成，該分配通道通過(guò)驅(qū)動(dòng)動(dòng)物的恒定壓力流動(dòng)來(lái)提供這些夾具的陣列。由于在沒(méi)有藥物治療或任何其他潛在傷害性措施的情況下進(jìn)行固定，該方法不會(huì)干擾蠕蟲(chóng)的天然生化狀態(tài)。此外，通過(guò)逆轉(zhuǎn)流動(dòng)的方向，蠕蟲(chóng)從陷阱中釋放出來(lái)，因此可以對(duì)同一群體進(jìn)行重復(fù)采樣。 芯片的入口和出口之間需要有恒定的壓差才能將蠕蟲(chóng)驅(qū)動(dòng)并捕獲到夾具中。必須強(qiáng)調(diào)的是一個(gè)恒定的壓力，重要的是  不 在這種情況下需要一個(gè)恒定的流量，因?yàn)楹愣鲃?dòng)狀態(tài)導(dǎo)致的壓力的無(wú)限增加會(huì)對(duì)固定蠕蟲(chóng)造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷。圖5顯示了微流體裝置的示意圖，該裝置基本上由一系列單獨(dú)的蝸桿夾具組成。通道被設(shè)計(jì)成可以逐漸卷繞，因此可以適應(yīng)不同大小的蠕蟲(chóng)，因?yàn)榧词乖谕蛉后w中，也可以發(fā)現(xiàn)個(gè)體之間明顯的尺寸差異。因此，該系統(tǒng)還可以作為分析設(shè)備來(lái)測(cè)量給定蠕蟲(chóng)種群的大小分布。此外，已經(jīng)選擇了高階分枝拓?fù)涞姆植?，以避免蠕蟲(chóng)在芯片內(nèi)分布的任何偏差。最后，由于被困蠕蟲(chóng)增加了給定通道的流體阻力，當(dāng)另一個(gè)蠕蟲(chóng)到達(dá)同一交叉點(diǎn)時(shí)，它不會(huì)沿著同一條路徑行進(jìn); 因此該裝置被設(shè)計(jì)為僅用一個(gè)蝸桿加載給定的夾具。但是，重要的是要注意，當(dāng)蠕蟲(chóng)被固定時(shí)，即不能控制蠕蟲(chóng)的方向，也就是說(shuō)，如果它被頭先捕獲或尾先捕獲。

圖5

總結(jié)起來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)（約15分鐘）可以在沒(méi)有任何化學(xué)化合物的情況下可逆地固定大量的線蟲(chóng)。這可以幫助研究人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中節(jié)省大量時(shí)間，并確保在所有觀察時(shí)間內(nèi)都能獲得高通量。此外，使用微流體裝置留下了可能被捕獲的線蟲(chóng)數(shù)量進(jìn)一步改善的可能性，并且還實(shí)施了添加其他微流體組分的新特征，例如用于藥物注射。最后，由于固定裝置產(chǎn)生有序蠕蟲(chóng)的陣列，原則上應(yīng)該可以使用電動(dòng)顯微鏡臺(tái)自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)。

4.  線蟲(chóng) 在微流控芯片上的壓縮固定

該技術(shù)由Trushal V. Chokshi（TV Chokshi  等，2009）開(kāi)發(fā)，它是前面描述的二氧化碳方法的變體。事實(shí)上，該設(shè)備的設(shè)計(jì)幾乎完全相同 - 一個(gè)雙層PDMS芯片 - 唯一的區(qū)別在于分隔兩層的隔膜。事實(shí)上，這次動(dòng)物的固定是機(jī)械地實(shí)現(xiàn)的：高壓（25psi）的空氣流動(dòng)導(dǎo)致膜在蝸桿上偏轉(zhuǎn)并壓縮蝸桿，從而抑制蝸桿的運(yùn)動(dòng)（圖6）。

圖6

為了使固定的效果最大化，進(jìn)行一些改變以使膜更易變形。首先，使用20：1的PDMS /固化劑混合比率而不是常規(guī)的10：1; 這使得PDMS彈性模量減少了兩倍。此外，固定模塊中微通道的寬度比鋸狀微通道（90μm）的寬度更寬（110μm），以允許較大的膜偏轉(zhuǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于制造微流體裝置的容易性及其進(jìn)一步的實(shí)施。此外，該技術(shù)適用于不同年齡的動(dòng)物，并且可以以串行方式應(yīng)用于大量蠕蟲(chóng)以增加吞吐量。

5. 線蟲(chóng) 固定在芯片-凝膠雜化微流體裝置

前面描述的方法對(duì)于形態(tài)學(xué)和表型調(diào)查是非常有效的，但是存在一些缺點(diǎn)。事實(shí)上，它們不允許縱向研究生理活性過(guò)程（例如冷卻方法）或者由于固定它們所使用的壓縮而引起蠕蟲(chóng)解剖特征的變化（例如，夾具和壓縮方法）。Jan Krajniak和Hang Lu（2010）針對(duì)這些問(wèn)題設(shè)計(jì)了一種混合型微流控芯片 - 凝膠系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在生理?xiàng)l件下對(duì)特定開(kāi)發(fā)過(guò)程進(jìn)行長(zhǎng)期高分辨率成像。特別是該設(shè)備能夠一次培養(yǎng)，固定和成像線蟲(chóng)。C.線蟲(chóng)的可逆固定化 通過(guò)使用生物相容性聚合物：Pluronic F127（PF127）來(lái)實(shí)現(xiàn)。事實(shí)上，這種聚合物能夠進(jìn)行可逆的溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變，可以通過(guò)小的溫度變化（?2°C）進(jìn)行熱誘導(dǎo)。特別是，當(dāng)PF127處于其凝膠狀態(tài)（凝膠化）時(shí)，其粘度增加的水平會(huì)抑制動(dòng)物的任何運(yùn)動(dòng)。所采用的微流體裝置是基于PDMS的雙層芯片（圖7），其中兩層由薄PDMS膜分開(kāi)。

圖7

一個(gè)模塊用于加載和流量控制，另一個(gè)用于溫度控制。兩個(gè)通道的厚度均為3 mm，而它們之間的隔膜為30μm。芯片的兩層用傳統(tǒng)的氧等離子體處理結(jié)合在一起。該裝置的一個(gè)關(guān)鍵特征是蠕蟲(chóng)在該裝置內(nèi)培養(yǎng)，因?yàn)楹笳吣軌驗(yàn)槠?個(gè)室內(nèi)的線蟲(chóng)提供營(yíng)養(yǎng)和氣體交換（圖8）。

圖7

此外，這些室用于在所有調(diào)查時(shí)間內(nèi)保持動(dòng)物分離，從而確保可以在單一動(dòng)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)育。流層包含所有流入口，這些入口用于加載蠕蟲(chóng)并向腔室供應(yīng)PF127溶液和各個(gè)培養(yǎng)室。此外，使用氣動(dòng)閥門(mén)以防止線蟲(chóng)從培養(yǎng)室逃逸。第二層是溫度控制模塊，它用于在設(shè)備上產(chǎn)生小的（幾°C）溫度變化以觸發(fā)PF127轉(zhuǎn)換。通過(guò)調(diào)節(jié)流量來(lái)實(shí)現(xiàn)精確的溫度控制的加熱流體并保持加熱流體源溫度。如前所述，所采用的固定機(jī)制依賴于PF127的溶液，PF127被導(dǎo)入培養(yǎng)室并進(jìn)入由熱轉(zhuǎn)變觸發(fā)的可逆溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變。因此固定在室內(nèi)的任何地方進(jìn)行，不依賴于蝸桿布置，并且具有最小的環(huán)境變化。總之，該方法能夠長(zhǎng)時(shí)間固定多達(dá)8個(gè)蠕蟲(chóng)而不干擾其生物學(xué)功能，此外，固定方案在完全可逆的情況下可以達(dá)到不確定的次數(shù)。

結(jié)論

  在這篇文章中，已經(jīng)提出了一些實(shí)現(xiàn)C. elegans 固定的最顯著的微流控方法  。特別強(qiáng)調(diào)了利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的明顯優(yōu)勢(shì)。常規(guī)固定方法主要依賴于膠水或麻醉藥物，已被證明是耗時(shí)，低通量且對(duì)樣品有害的?，F(xiàn)在出現(xiàn)的明顯問(wèn)題是：  我應(yīng)該選擇哪種微流控技術(shù)？

這個(gè)問(wèn)題沒(méi)有特定的答案，哪種技術(shù)最適合你，這取決于你的要求和需求。此外，這些方法中的每一種在線蟲(chóng)  固定化方面確保非常好的結(jié)果  。無(wú)論如何，其中Chokshi的方法提供了最佳的折中方面的制造困難表現(xiàn)。所采用的微流控裝置實(shí)際上相當(dāng)簡(jiǎn)單，因?yàn)樗且粋€(gè)雙層PDMS芯片與一個(gè)簡(jiǎn)單的通道陣列。此外，如果研究人員要求短時(shí)間（分鐘）或長(zhǎng)時(shí)間（小時(shí)）固定時(shí)間，則可以使用相同的設(shè)計(jì)用于兩種固定技術(shù)（壓縮和CO2）。此外，這種方法可以應(yīng)用于不同年齡組的蠕蟲(chóng)，并允許動(dòng)物完全恢復(fù)固定。

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