作者：肖星凝

常用的PCR檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳和實時定量PCR (qPCR)。瓊脂糖凝膠電泳是一種簡單、成本低廉的方法，結果直觀，但只能說明產(chǎn)品的存在性和純度。qPCR是一種半定量檢測核酸的方法，已廣泛應用于實驗室和醫(yī)院。然而，qPCR對DNA濃度的絕對定量需要一系列標準的擴增曲線，增加了整個實驗的成本和復雜度。此外，當PCR擴增在體反應中進行時，定量罕見的靶標是困難的，在體反應中，大量的非靶標序列與靶標競爭PCR引物。因此，qPCR在檢測循環(huán)腫瘤DNA和罕見突變DNA等方面存在不足。

新興的高靈敏度數(shù)字PCR(dPCR)技術具有絕對準確的定量分析優(yōu)勢，是一項很有發(fā)展前途的技術。在該技術中，DNA樣品被稀釋并分割成大量的平行小室，大部分的共組分要么含有單個目標DNA，要么不含有目標DNA，從而可以對單個目標DNA進行擴增并分別檢測到。定量的“是或否”終點信號被用來對陽性和陰性的區(qū)隔進行評分，因此通過對陽性區(qū)隔的計數(shù)，dPCR可以確定一個復雜種群中存在的初始DNA靶點的總數(shù)?，F(xiàn)有的dPCR技術一般分為兩大類:基于drop-baseddPCR(ddPCR)和基于chamber-based dPCR (cdPCR)。 ddPCR具有最高的靈敏度和準確性，因為它可以實現(xiàn)乳液中反應液滴的數(shù)量最多，但這種平行液滴群體的生成和轉移需要時間和復雜的操作。cdPCR有許多預制的微、納米或皮升油層。與ddPCR相比，cdPCR具有包間大小均勻、加載樣品速度快、交叉污染最小等優(yōu)點。

然而，復雜的制造工藝增加了成本，限制了腔室的數(shù)量。此外，這些dPCR方法大多使用熒光團作為信號標簽，需要昂貴的高靈敏度熒光顯微鏡或流式細胞儀等專用儀器進行信號檢測，可能面臨高背景噪聲等挑戰(zhàn)。因此，一種低成本、低背景噪聲、簡單靈敏的dPCR方法仍然是滿足dPCR作為常規(guī)程序在正常流產(chǎn)和臨床應用中的迫切需要。光束法是一種乳化液數(shù)字PCR技術。在光束傳輸中，單個目標DNA被放大到單個磁珠上，磁珠被包裹在油包水(W/O)乳劑的液滴中。擴增后，將目標DNA的群體轉化為目標磁珠的群體，磁珠上覆蓋著成千上萬的目標DNA拷貝。通過對靶珠數(shù)量的計數(shù)，可以確定靶DNA的初始數(shù)量。該團隊開發(fā)了一種新的基于波束形成、微球和微柱陣列芯片的dPCR方法，原理圖如下。

圖1 (a)和(b)混合磁珠和上游引物及樣品；(c)乳化混合物及聚合酶鏈反應； (d)放大單目標DNA；(e)液滴破碎；(f)捕獲改性聚苯乙烯微球；(g)從微球上分離游離磁珠；(h)捕獲磁珠陣列芯片。

芯片的制作流程，見圖2，首先，將光刻膠自旋涂覆在硅片上，并采用光刻工藝進行圖形化,。在此基礎上，采用深反應離子蝕刻技術進一步形成晶圓內的微孔陣列。然后用濃硫酸清洗硅母材。PDMS[預聚物與交聯(lián)劑的比例為10:1 (w/w)]板坯成型前，母材在真空下連夜暴露于三氯氣(1H、1H、2H、2H-全氟辛基)硅烷(Sigma-Aldrich,USA)蒸汽中，以降低表面能，促進PDMS板坯從硅母材中后續(xù)釋放。然后混合物被倒在硅烷主和孵化30分鐘，形成一個結構板。固化后，板被剝離，并穿孔，以創(chuàng)建進出口端口，最后通過等離子體處理將PDMS板與玻片牢固粘結。

圖2 芯片制作流程

為了獲得較為均勻和合適的液滴尺寸，測定了組織溶栓的振動頻率。我們在20s固定的振動時間內嘗試不同的頻率，發(fā)現(xiàn)在32Hz以下的乳液具有相對均勻的水滴大小(圖a)。大多數(shù)乳劑的直徑是10至15μm。根據(jù)這個尺寸,我們估計的乳液中混合將包含約2.4×10⁷ -8×10⁷滴。（b）磁珠與液滴的比例很重要。磁珠過多，一個液滴可包裹多個磁珠；磁珠過少的話，會影響回收率。（c）為了評價乳液的質量和熱穩(wěn)定性，將乳液滴在玻片上，發(fā)現(xiàn)乳液中液滴的大小和均勻性在熱循環(huán)后沒有發(fā)生變化，這說明了在PCR過程中乳液的熱穩(wěn)定性。

圖3 a) 乳液中液滴的性質。(a)不同振動頻率下乳液的特性；(b)一個乳狀液艙內的單顆珠子的照片；(c)乳液熱循環(huán)前(左)和熱循環(huán)后(右)的照片。

在破乳過程中，磁珠有一定的損失。珠子的回收率很重要，因為回收率低可能會給結果帶來較大的檢測誤差，所以我們對乳液破碎過程中磁珠的回收率進行了評估(圖a)。在第一次破壞后，珠子被離心，然后用磁鐵收集。將收集到的磁珠懸浮在與基準體積相同的位置，用分光計進行測量，共回收磁珠總量的55%左右。然后將上清液移到另一根試管中，再次重復破碎和收集的過程，大約有5%的磁珠。第三次，就幾乎沒有。確定了微球的平均回收率為60%。

圖4 磁珠的回收率及其對檢測的影響。(a)磁珠在不同破碎時間的回收率；(b)在回收率為60%的情況下，對不同數(shù)目的tamb進行檢測，總體檢測錯誤；(c)在60%的檢測率下，檢測不同數(shù)量的TAMB時的CV值。

圖5 （a）上清液中游離微球和沉淀物中MBCs，研究了不同洗滌次數(shù)后殘留微球的數(shù)量。（b）經(jīng)過1次、2次洗滌后，殘余微球數(shù)量急劇減少，3次洗滌后逐漸減少，說明大部分游離微球已被洗滌3次后清除。確定理想的洗滌時間是4。

圖6 定量檢測目標DNA。(a)定量檢測結果標準樣品濃度范圍為0.1fm(≈60copies) ~5fm(≈3000copies)；(b)一系列臨床樣本稀釋的定量檢測結果。右邊的數(shù)字表示每個樣本濃度中計算的MBCs。

點評：

1.本文提出了一種基于微球、乳劑、放大、磁(束)、微球和微柱陣列芯片的核酸定量方法。我們利用鏈霉親和素(SA)改性聚苯乙烯微球捕獲生物素包覆的靶珠，該靶珠可以代表靶DNA的總體。然后將微球-微珠復合物收集到微柱陣列芯片中，在普通顯微鏡下觀察。由于微球-珠粒配合物的數(shù)量與靶DNA的數(shù)量呈耦合泊松分布關系，因此通過計算芯片捕獲微球的數(shù)量可以很容易地推斷出靶DNA的數(shù)量。

2.該方法降低了成本，降低了數(shù)字PCR技術的難度，有望促進數(shù)字PCR技術在科研和臨床領域的應用。

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