在臨床治療中, 植入自體細(xì)胞(考慮到組織的相容性)進(jìn)行組織修復(fù)和重建常被認(rèn)為是最佳的治療方法. 考慮到自身組織移植會造成二次創(chuàng)傷, 獲取大量自體細(xì)胞最直接的途徑就是進(jìn)行細(xì)胞的體外培養(yǎng). 一些研究發(fā)現(xiàn)適宜的物理微環(huán)境是細(xì)胞生長不可或缺的因素, 在體外培養(yǎng)時生物灌流反應(yīng)器(如圖1)可以方便地模擬體內(nèi)多種物理微環(huán)境. 許多實驗室引入了不同的生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng), 并證明了液流有利于組織的構(gòu)建。相比靜態(tài)培養(yǎng), 微流控培養(yǎng)腔中的細(xì)胞在移植后會對體內(nèi)的微流動環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性. 人體的一些組織結(jié)構(gòu)(例如骨)在受到外力時會產(chǎn)生變形, 進(jìn)而在組織內(nèi)微液流環(huán)境中形成孔隙壓力和流動電位, 這些力、電信號微環(huán)境進(jìn)一步調(diào)控當(dāng)?shù)亟M織細(xì)胞的生長、分化, 最終使組織(重/塑建)適應(yīng)外部載荷環(huán)境. 在體外細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器上也可施加壓力和電場進(jìn)行驅(qū)動來模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的力–電微環(huán)境. 很多學(xué)者的工作也已經(jīng)證明壓力和電場的干預(yù)可以調(diào)控細(xì)胞的生長、分化, 雖然明確的作用機(jī)理(通路)還不是很清楚, 但已明確的事實是壓力梯度和電場驅(qū)動液體流動產(chǎn)生的流體切應(yīng)力對細(xì)胞生長、分化起到了至關(guān)重要的作用.

細(xì)胞可以感受不同大小的切應(yīng)力并能做出相應(yīng)的響應(yīng), 能較好地將這些細(xì)胞能感受的力電信號和宏觀的外載荷聯(lián)系起來, 微流動場被認(rèn)為是信號傳導(dǎo)的最佳媒介. Chang等[8]得到了牛頓型液體在電場驅(qū)動下的流速分布, Ganguly等考慮了電和磁對壓力驅(qū)動流傳熱特性的影響, Movahed等對比了壓力和電場驅(qū)動小型設(shè)備中液流的優(yōu)劣. 這些研究背景均基于微流控技術(shù), 以討論外力和流速的關(guān)系為主, 微流控技術(shù)以其用料少、操作性強(qiáng)和便于觀察分析等優(yōu)點, 近年來受到眾多領(lǐng)域?qū)W者的青睞. 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域, Pappas[11]在對癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散進(jìn)行分析時, 利用微流控技術(shù)建立可控規(guī)模的反應(yīng)區(qū)評估癌細(xì)胞和器官的相互作用. Uzel等在微流控芯片上設(shè)定不同的生化梯度, 用于模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的化學(xué)微環(huán)境. Sun等[13]則將微流控芯片應(yīng)用于細(xì)胞的篩選工作, 并通過電場實現(xiàn)微閥控制. 這些研究均以實驗和有限元建模為主要手段, 并未建立系統(tǒng)的理論模型進(jìn)行具體量化分析, 并探明如下調(diào)控機(jī)制: 外部物理驅(qū)動場→微流體流動行為(流體切應(yīng)力等)→細(xì)胞的生長/分化

在細(xì)胞動態(tài)流動培養(yǎng)腔中, 細(xì)胞多用黏附分子(整合素)將自身吸附在培養(yǎng)腔壁上(避免被液流帶走), 這樣使得液流對細(xì)胞的力學(xué)刺激作用集中在腔壁附近. Becquart等[15]研究發(fā)現(xiàn), 處于液體環(huán)境中的細(xì)胞能感知靜水壓力及流體剪切力的刺激信號,并且發(fā)現(xiàn)流體剪切力比靜水壓力對引起相關(guān)基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用更大. Stavenschi等在實驗中利用壓力驅(qū)動對比了不同大小和頻率的切應(yīng)力下細(xì)胞的基因表達(dá)效果, 結(jié)果表明2 Pa、2 Hz的切應(yīng)力刺激最有利于成骨基因的表達(dá). Zhang等也通過實驗發(fā)現(xiàn)了人類間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)基因的表達(dá)和流體切應(yīng)力有極大的關(guān)系, 該信號傳導(dǎo)過程也受到供體變異性的影響. 此外, Zheng等同樣通過實驗探究出壓力驅(qū)動作用下的切應(yīng)力影響細(xì)胞對刺激的反應(yīng)時間, 并發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力較大時有利于縮短該反應(yīng)時間.液體壓力梯度驅(qū)動流對細(xì)胞培養(yǎng)的影響的研究大多停留在實驗層面, 理論方面鮮有報道. 當(dāng)使用壓力梯度驅(qū)動液體在較長的細(xì)胞培養(yǎng)腔流動時, 力信號的傳遞從施力點(管口)到管段中央具有延遲性.Glawdel等將電場驅(qū)動引入到細(xì)胞的體外培養(yǎng),因為電場力屬于體力, 這樣就可以避免上述壓力梯度驅(qū)動力信號沿著腔體長度方向的耗散延遲, 從而保證腔內(nèi)各個位置細(xì)胞附近的流體切應(yīng)力信號均勻. 同細(xì)胞培養(yǎng)腔中的壓力驅(qū)動技術(shù)類似, 電場驅(qū)動或力–電協(xié)同驅(qū)動研究大多以實驗為主, 例如王淞等通過實驗觀察得出電場對表皮干細(xì)胞的增殖有影響, 內(nèi)源性生物電場具有引導(dǎo)其向陰極定向遷移的作用, Kumar等在壓力驅(qū)動流中添加電場作用后細(xì)胞的成骨響應(yīng)明顯增強(qiáng), 而相關(guān)的力–電協(xié)同驅(qū)動下的細(xì)胞培養(yǎng)腔理論研究較少.

考慮到人體內(nèi)復(fù)雜的生理載荷環(huán)境, 壓力和電場在組織內(nèi)并存. 因此, 在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的實際需要組合施加相應(yīng)的物理場(壓力梯度或電場), 使其所處的環(huán)境更接近于生理物理環(huán)境.以上研究均沒有得到具體的外部物理驅(qū)動場與相應(yīng)培養(yǎng)腔內(nèi)液體流動行為的量化關(guān)系, 而這是進(jìn)一步研究流體刺激特別是力–電協(xié)同刺激細(xì)胞生長或分化機(jī)理的前提. 為此, 本文將分別建立壓力梯度、電場和力–電協(xié)同三種驅(qū)動模式下的矩形細(xì)胞培養(yǎng)流動腔(平行板培養(yǎng)皿)理論模型, 求解得到相應(yīng)的流速、切應(yīng)力和流率的解析解, 揭示出培養(yǎng)腔中的液體流動規(guī)律, 并將這些解答和實際的細(xì)胞培養(yǎng)等生理意義聯(lián)系起來. 該模型的建立有助于細(xì)胞微流控培養(yǎng)實驗系統(tǒng)及細(xì)胞力學(xué)參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計.

1模型建立

假設(shè)培養(yǎng)液為不可壓縮的牛頓流體, 在培養(yǎng)腔內(nèi)的流動可以用下面的式子(動量方程和連續(xù)性方程)來描述

其中,u是流體速度矢量,p表示液體壓強(qiáng),f是流體所受的體力,ρ為細(xì)胞培養(yǎng)液的密度,μ是培養(yǎng)液的動力黏度. ?u/?t和u·▽u分別是瞬態(tài)項和對流項,△為Laplace算子,▽為梯度算子. 對于生物反應(yīng)器微流控芯片(如圖1所示)上的矩形細(xì)胞培養(yǎng)流動腔(平行板培養(yǎng)皿), 忽略腔寬的影響, 在直角坐標(biāo)系(x,y)下, 培養(yǎng)腔內(nèi)的流體可以簡化為二維流動模型(上下腔壁間高為2h, 腔長為l), 在固液界面上的邊界條件為無滑移.

壓力梯度驅(qū)動流模型的建立

根據(jù)不可壓縮條件, N-S動量方程(1)中的對流項將消失. 由腔管的對稱性, 只需對矩形微腔管中心線的上半部分進(jìn)行研究. 由于微管通道寬度遠(yuǎn)大于高度, 因此可以忽略矩形微通道的寬度(z方向)對沿高度方向上的流速分布的影響. 若微管高度y方向的速度為零, 只考慮x方向的流動, 壓強(qiáng)p僅是關(guān)于x和時間變量t的函數(shù), 忽略體力的影響, 壓力梯度驅(qū)動液流在xy截面上的N-S動量方程可以表示為

其中,up(y,t)是壓力梯度驅(qū)動時x方向的流速分量,?p/?x和ωp分別是沿著x方向的壓力梯度和振蕩角頻率(ωp= 2πfp), 其中–?p/?x=P0/l, 負(fù)號“–”表示壓力沿流道方向下降,P0是進(jìn)出口壓力差的幅值. 上述方程滿足邊界條件

引入無量綱化參數(shù)

控制方程(3)變?yōu)?/span>

假設(shè)流速分布滿足初始條件

引入拉普拉斯(Laplace)變換

結(jié)合式(7)和式(8)對式(6)進(jìn)行Laplace變換后有

求解方程(9), 利用海維賽(Heaviside)公式[22]對其結(jié)果進(jìn)行Laplace逆變換, 并還原無量綱化參數(shù)得壓力梯度驅(qū)動下的流速分布為

切應(yīng)力τyx分布和流率Q可以表示為

根據(jù)式(10)和式(11)可以得到壓力梯度驅(qū)動作用下切應(yīng)力和流率的分布規(guī)律為

以上各式中Rep=ρωph2/μ稱為壓力梯度驅(qū)動流的振蕩雷諾數(shù),w和l分別為矩形微管通道的寬度和長度.

電場驅(qū)動流模型的建立

同壓力梯度驅(qū)動流的假設(shè)相同, 不考慮x方向的壓力梯度的影響, 電場驅(qū)動下的方程(1)可以表示為

其中,ue(y,t)是電場驅(qū)動時x方向的流速分量(只考慮x方向的流動),ρe是液流中凈電荷分布密度,E0和ωe分別是沿著x方向電場的幅值和振蕩角頻率(ωe= 2πfe). 上述方程滿足邊界條件

由靜電學(xué)理論可知單位體積內(nèi)的凈電荷密度ρe的值取決于雙電層(EDL)電勢, 對于低的EDL電勢ψ, 若電勢能遠(yuǎn)低于熱能, 運(yùn)用Debye-Hückel的線性化近似后可得Poisson-Boltzmann方程[23]

且滿足邊界條件

求解得凈電荷密度分布

控制方程(14)變?yōu)?/span>

假設(shè)流速分布滿足初始條件(7), 結(jié)合式(8)對式(20)進(jìn)行Laplace變換后有

求解方程(21), 利用Heaviside公式對其結(jié)果進(jìn)行Laplace逆變換, 并還原無量綱化參數(shù)得電場驅(qū)動下的流速分布為

根據(jù)式(11)和式(22), 最終可以得到電場驅(qū)動作用下切應(yīng)力和流率的分布規(guī)律為

以上各式中Ree=ρωeh2/μ稱為電場驅(qū)動流的振蕩雷諾數(shù),w為矩形微管通道的寬度.

力–電協(xié)同驅(qū)動流模型的建立

考慮力–電協(xié)同作用時, 方程(1)同時保留壓力梯度項和體力項(電場力). 這時在xy截面方程變?yōu)?/span>

其中ωp為壓力的振蕩角頻率(ωp= 2πfp),ωe為電場的振蕩角頻率(ωe= 2πfe). 方程(25)滿足邊界條件

引用式(5)和式(19)的無量綱化參數(shù), 將式(25)及其邊界條件(26)無量綱化后進(jìn)行Laplace變換并求解可得

將式(27)進(jìn)行Laplace逆變換并還原無量綱參數(shù)可得: 力–電協(xié)同作用下的流速解答為壓力梯度、電場單獨作用時解答的代數(shù)和, 即為

將式(28)代入式(29)可得, 力–電協(xié)同作用下切應(yīng)力和流率的解析解也為壓力梯度、電場單獨作用所得結(jié)果的代數(shù)和

2數(shù)值參數(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)液中的電解質(zhì)以NaCl為主, 其濃度設(shè)定為10-6mol/L, 微通道腔壁上對應(yīng)的Zeta電勢為–0.2 V[25], 其他參數(shù)見表1. 溫度的變化會影響培養(yǎng)液的粘度和密度, 其對應(yīng)關(guān)系見表2

                                        表1幾何及物理參數(shù)

3結(jié)果

3.1時程曲線

圖2繪制了壓力梯度驅(qū)動頻率為2 Hz和電場驅(qū)動頻率分別為1 Hz和2 Hz的時程曲線. 各驅(qū)動力時程曲線均為余弦曲線, 波峰代表沿著x軸正向的最大值, 波谷則代表反向的最大值. 從圖3可以看出力–電協(xié)同驅(qū)動結(jié)果是壓力、電場驅(qū)動單獨作用結(jié)果的代數(shù)和.圖3(a)、圖3(c)、圖3(e)分別繪制了壓力、電場及力–電協(xié)同三種模式在不同步驅(qū)動(fp= 2 Hz,fe= 1 Hz)時腔心(y= 0)流速、腔壁(y=h, 細(xì)胞貼壁處)上切應(yīng)力及流率的時程曲線. 當(dāng)壓力梯度(t= 0.25 s)和電場(t= 0.5 s)載荷到達(dá)波谷時,各自的響應(yīng)(流速、切應(yīng)力和流率)同時到達(dá)波谷;壓力梯度(t= 0.5 s)和電場(t= 1 s)載荷到達(dá)波峰時, 各自的響應(yīng)也同時到達(dá)波峰. 力–電協(xié)同的響應(yīng)值在部分時段相互削弱, 幅值達(dá)到最小值(t= 0.5 s);部分時段疊加增強(qiáng), 幅值可達(dá)到最大值(t= 1 s).圖3(b)、圖3(d)、圖3(f)則繪制了三種模式在同步驅(qū)動(fp=2 Hz,fe= 2 Hz)時的時程曲線, 壓力梯度和電場載荷到達(dá)波谷(t= 0.25 s)和波峰(t= 0.5 s)時, 各自的響應(yīng)值也同時到達(dá)波谷和波峰. 力–電協(xié)同作用時,流速、切應(yīng)力及流率同步疊加增強(qiáng), 其時程曲線與壓力梯度和電場同時到達(dá)波峰和波谷, 且幅值達(dá)到最大值. 據(jù)此, 本文主要研究增強(qiáng)效果比較明顯的壓力和電場在同步協(xié)同驅(qū)動的情況.

              表2不同溫度下的培養(yǎng)液的黏度和密度

圖 2   壓力和電場隨時間的變化

圖 3   流速、切應(yīng)力和流率隨時間的變化

3.2流速幅值分布

圖4為壓力梯度驅(qū)動下流速幅值隨著壓力、腔高、頻率、溫度的變化圖, 由圖4可知: 從腔壁(y=±h)到腔心(y= 0), 流速從零非線性增大到最大值,在培養(yǎng)腔內(nèi)呈“拱形”分布. 隨著壓力、腔高和溫度的增大, 腔內(nèi)各處的流速均隨之增大(見圖4(a)、圖4(b)、圖4(d)), 但頻率增大時流速卻減小(見圖4(c)). 對比各處的流速變化可知, 腔心處的流速變化最大, 腔壁處的流速變化最小.

圖5為電場驅(qū)動下流速幅值隨著電場、腔高、頻率、溫度的變化圖, 流速在培養(yǎng)腔內(nèi)呈“梯形”分布. 在電場的作用下, 培養(yǎng)腔內(nèi)的流速在一定區(qū)域內(nèi)(y= – 0.998h～0.998h)保持恒定. 當(dāng)電場強(qiáng)度和溫度增大時, 該恒定流速隨之線性增大(見圖5(a)和圖5(d)). 腔高和頻率增大時, 相同區(qū)域內(nèi)流速則不能保持恒定, 腔心附近的流速會隨之減小, 但腔壁附近(約為y= ± 0.998h處)的流速卻能保持不變(見圖5(b)和圖5(c)). 此外, 由圖5(d)可知溫度對流速的影響較小, 所以電場驅(qū)動下腔壁附近的流速主要受控于電場強(qiáng)度.

對比圖4和圖5可以發(fā)現(xiàn), 壓力僅在腔心部分驅(qū)動液體產(chǎn)生流速, 而電場驅(qū)動卻能在整個腔體維持一定的流速. 壓力幅值(P0= 400～520 Pa)和電場幅值(E0= (1.2～2.0) × 105V/m)一定時, 壓力梯度驅(qū)動得到的最大流速幅值較電場驅(qū)動的大(約為2～6倍). 對比圖4(a)、圖(d)和圖5(a)、圖(d), 場強(qiáng)和溫度的增大均能使得兩場作用下的流速增大,壓力梯度驅(qū)動下增大趨勢在腔心處明顯, 電場驅(qū)動下增大趨勢則分布整個腔體. 對比圖4(b)和圖5(b),腔高變化對腔心處流速的影響非常明顯, 隨著腔高增大, 壓力梯度驅(qū)動下的腔心流速逐漸增大, 而電場驅(qū)動下的腔心流速逐漸變小. 當(dāng)腔高變化量相同時,壓力梯度驅(qū)動下腔心流速幅值的變化范圍要遠(yuǎn)大于電場驅(qū)動下的變化(約為200倍). 由此可見：腔高變化對電場驅(qū)動液體流動行為的影響遠(yuǎn)小于壓力梯度. 對比圖4(c)和圖5(c), 兩場的驅(qū)動頻率增大時,流速變化均出現(xiàn)在腔心附近且呈減小趨勢.

圖6繪制了力–電協(xié)同(同步)驅(qū)動下的流速幅值隨著場強(qiáng)、腔高、頻率、溫度的變化圖, 在力–電協(xié)同作用下, 腔內(nèi)各處均能保持一定的流速. 當(dāng)壓力/電場強(qiáng)度和溫度的增大時, 腔內(nèi)各處的流速均隨之增大, 腔心處的流速變化要大于腔壁處(見圖6(a)、圖6(d)). 但腔高減小或頻率增大時, 腔心附近的流速減小, 腔壁附近的流速則保持不變(見圖6(b)、圖6(c)). 力–電協(xié)同作用時, 壓力(P0= 460 Pa)和電場(E0= 2 × 105V/m)一定時, 腔壁附近(約為y= ±0.95h處)的流速主要由電場驅(qū)動(約占80%)提供,腔心附近的流速主要由壓力梯度驅(qū)動(約占70%)提供, 可見電場的作用彌補(bǔ)了壓力梯度驅(qū)動在腔壁附近流速小的劣勢. 對比圖4、圖5和圖6可知: 力–電協(xié)同作用時, 腔心附近的流速可以通過壓力、腔高、頻率、溫度四個參量進(jìn)行調(diào)控, 但腔壁附近流速通過電場調(diào)控較為明顯.

圖 4   壓力梯度驅(qū)動下流速幅值在不同壓力、腔高、頻率、溫度的分布

圖 5   電場驅(qū)動下流速幅值在不同電場、腔高、頻率、溫度的分布

3.3腔壁上的切應(yīng)力幅值

圖7繪制了壓力、電場和力–電(fp=fe= 1 Hz)協(xié)同驅(qū)動三種驅(qū)動模式下, 腔壁上(y= ±h, 細(xì)胞貼壁處)流體切應(yīng)力幅值隨壓力、電場、腔高、頻率、溫度的的變化規(guī)律. 由圖7(a)和圖7(b)可知,切應(yīng)力幅值隨著壓力和電場的場強(qiáng)幅值增大呈線性增長, 當(dāng)切應(yīng)力幅值增大量相同時, 電場的變化值要遠(yuǎn)大于壓力的變化值(約為50倍), 由此可見電場驅(qū)動時電場強(qiáng)度具有更大的調(diào)節(jié)空間. 對比圖7(a)和圖7(b), 壓力(P0= 400～520 Pa)驅(qū)動下的切應(yīng)力僅為電場(E0= (0.6～1) × 104V/m)驅(qū)動下切應(yīng)力的1/4. 當(dāng)壓力(P0= 460 Pa)一定時, 切應(yīng)力幅值隨著腔高增大線性增大(見圖7(c)), 隨著頻率的增大非線性減小(見圖7(d)), 隨著溫度的變化基本保持不變(見圖7(e)). 在電場(E0= 104V/m)驅(qū)動下, 腔高、頻率和溫度的改變時, 切應(yīng)力基本保持不變. 力–電協(xié)同作用下切應(yīng)力隨各量的變化趨勢和壓力梯度驅(qū)動下的變化趨勢相近, 其切應(yīng)力結(jié)果為力、電單獨作用下切應(yīng)力的代數(shù)和. 對比三種驅(qū)動模式下切應(yīng)力的變化可知: 壓力梯度驅(qū)動下, 影響切應(yīng)力變化的外因較多, 可控性差; 電場驅(qū)動下, 切應(yīng)力僅受控于電場強(qiáng)度, 受其它條件約束少, 可控性強(qiáng).

圖 6   力–電協(xié)同驅(qū)動下流速幅值在不同場強(qiáng)、腔高、頻率、溫度的分布

3.4流率幅值

圖8是三種驅(qū)動模式下流率幅值隨壓力、電場、腔高、頻率、溫度的變化曲線. 由圖8(a)、圖8(b)、圖8(e)可知: 當(dāng)壓力、電場和溫度升高時, 三種驅(qū)動模式下的流率均線性增大. 當(dāng)腔高增大時, 壓力梯度驅(qū)動及力–電協(xié)同驅(qū)動下的流率呈非線性增大, 電場驅(qū)動下的流率保持不變(見圖8(c)). 當(dāng)頻率增大時, 三種模式下的流率均呈非線性減小(見圖8(d)). 與圖7對比, 在施加的壓力和電場幅值一定(P0= 460 Pa,E0= 104V/m)的情況下, 電場驅(qū)動得到的切應(yīng)力比壓力梯度驅(qū)動的大(約為4～9倍),但電場驅(qū)動下的流率卻遠(yuǎn)小于壓力梯度驅(qū)動(約為1/30).

4討論

本文建立了基于微流控的矩形(腔寬遠(yuǎn)大于腔高)細(xì)胞培養(yǎng)流動腔的理論模型, 該模型可以用來進(jìn)一步量化其內(nèi)部液體的壓力、流速、腔壁(細(xì)胞貼壁處)的切應(yīng)力和流率分布, 并得到了壓力梯度、電場、力–電協(xié)同驅(qū)動微液流動的解析解. 根據(jù)Stavenschi等的實驗參數(shù)將腔高設(shè)置為300 μm、進(jìn)出口壓力差的幅值和頻率分別為460 Pa和1 Hz時, 模型計算出的流體切應(yīng)力和流率分別為 0.92 Pa及 45.24 mL/min, 理論計算值與實驗結(jié)果基本吻合(如表3所示). 本文詳細(xì)考察了外部物理場載荷(壓力和電場驅(qū)動幅值、頻率)和環(huán)境(腔高、溫度)參數(shù)對細(xì)胞培養(yǎng)的微流動刺激的影響, 同時也對比了各自物理場驅(qū)動的效果, 為外加物理場刺激組織(細(xì)胞)生長的機(jī)理研究提供理論參考

表3壓力梯度驅(qū)動下理論值和Stavenschi等實驗值的對比

考慮到人體組織承受的生理載荷環(huán)境, 采用周期性載荷的驅(qū)動方式(振蕩流), 以更接近細(xì)胞的體內(nèi)生理環(huán)境。相關(guān)研究表明振蕩流可以促進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)腔中更加均勻分布和增殖. 壓力和電場單獨驅(qū)動液體流動時, 由時程曲線(圖3)可知施加的驅(qū)動載荷和流體刺激結(jié)果(腔心流速、腔壁切應(yīng)力、流率)均能同步達(dá)到峰值, 這說明當(dāng)培養(yǎng)液的黏性較小時, 細(xì)胞感受力學(xué)信號的即時性非常好. 當(dāng)壓力和電場協(xié)同作用時, 結(jié)果呈線性疊加關(guān)系, 可見壓力和電場之間不存在相互干擾. 在微流控培養(yǎng)過程中, 細(xì)胞的正常生長/分化需要定量的流速、切應(yīng)力和流率, 三者缺一不可, 但單獨的壓力和電場驅(qū)動卻不能保證三者均在引起細(xì)胞響應(yīng)的流體刺激范圍(流速為400～800 μm/s、切應(yīng)力為0.2～6 Pa[31])之內(nèi)(見圖4、圖5、圖7). 由圖3～圖8可知: 兩驅(qū)動場相比, 電場驅(qū)動善于提供較大的腔壁流速和切應(yīng)力, 壓力梯度驅(qū)動善于提供較大的流率. 壓力梯度驅(qū)動對細(xì)胞貼壁處流體的控制能力較弱, 而電場恰好能彌補(bǔ)這一不足. 因此, 力–電協(xié)同驅(qū)動的效果(流速、切應(yīng)力和流率均具有可調(diào)控性)將更加明顯. 從圖3還可看出, 當(dāng)壓力和電場驅(qū)動同步時(頻率相同), 流體刺激結(jié)果同步線性疊加且相互不干擾, 力–電協(xié)同作用下液流刺激效果增強(qiáng)最為明顯.

圖 7   腔壁上切應(yīng)力幅值隨壓力、電場、腔高、頻率、溫度的變化

流速的增大對細(xì)胞均勻分布生長有一定的促進(jìn)作用, 這可能是由于流速的改變會影響營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸速率, 進(jìn)而改變細(xì)胞的生長取向. 速度梯度(y軸方向)的增大也會引起較強(qiáng)的剪切刺激, 研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液流速會影響骨細(xì)胞形態(tài)和胞外基質(zhì)的分泌和沉積, 灌流速度為 400～800 μm/s時成骨響應(yīng)最佳. 由于培養(yǎng)過程中細(xì)胞大多貼壁生長, 因此控制腔壁附近的流速至關(guān)重要. 在腔壁附近, 壓力梯度驅(qū)動流下的流速基本接近于零(見圖4), 而電場驅(qū)動流卻能保持相對穩(wěn)定的流速(見圖5), 這與song等所得流速圖的結(jié)果大致吻合. 由圖6可知力–電協(xié)同作用時腔壁附近的流速大小主要由電場來調(diào)控: 為了在腔壁附近獲得相對穩(wěn)定的流速, 可通過改變電場強(qiáng)度來實現(xiàn)(見圖5(a)). 當(dāng)電場強(qiáng)度控制為2 ×105V/m時, 距離腔壁約h/500處的流速大小保持為0.038 m/s, 由于流速正比于電場場強(qiáng)(與Bera等所得的流速與電場場強(qiáng)成線性增長關(guān)系的結(jié)果一致), 為了滿足成骨的最佳響應(yīng)值(400～800 μm/s),電場強(qiáng)度應(yīng)減小50～100倍. 如果流速代表物質(zhì)的運(yùn)輸速率, 流率則代表著單位時間內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸量,保證腔壁處的流體刺激(流速及切應(yīng)力(0.2～6 Pa[31]))在細(xì)胞響應(yīng)范圍內(nèi)的同時, 為了滿足細(xì)胞的新陳代謝——養(yǎng)料、廢物的及時供應(yīng)與排除, 也需要保證一定的流率。流率因驅(qū)動方式的不同而不同, 從圖8可以看出: 在一定的驅(qū)動幅值內(nèi), 電場驅(qū)動(E0= 104V/m)下的流率遠(yuǎn)小于壓力梯度驅(qū)動(P0=460 Pa)下的, 當(dāng)力–電協(xié)同作用時可獲得較大的流率. 壓力梯度驅(qū)動下流率的波動范圍受驅(qū)動載荷和環(huán)境參數(shù)的影響較大, 可以根據(jù)實際需要選擇力–電協(xié)同驅(qū)動模式彌補(bǔ)不足.

圖 8   流率隨壓力、電場、腔高、頻率、溫度的變化

流體剪切應(yīng)力是刺激細(xì)胞響應(yīng)的重要力學(xué)因素信號, 在細(xì)胞微流控培養(yǎng)的生物反應(yīng)器設(shè)計中是被著重考慮的流體刺激因子. 一些研究根據(jù)流率估算切應(yīng)力, 且認(rèn)為距離腔壁小于h/4的范圍內(nèi)均受切應(yīng)力的影響, 本文則根據(jù)牛頓內(nèi)摩擦定律精確獲得了腔壁處流體切應(yīng)力的大小. 腔壁處切應(yīng)力隨著壓力和電場的增大均呈線性增大趨勢, 與壓力梯度驅(qū)動相比腔高的變化對電場驅(qū)動下的切應(yīng)力基本沒有影響(圖7). 根據(jù)腔壁處流速的取值(400～800 μm/s)可以確定電場的變化范圍應(yīng)為2 000～4 000 V/m, 相應(yīng)得到的切應(yīng)力范圍約為1～2 Pa. 基因的表達(dá)決定著細(xì)胞的分化方向, 總結(jié)Stavenschi等[6]實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力為2 Pa時對成骨的相關(guān)基因表達(dá)最有利, 可見調(diào)節(jié)外部電場強(qiáng)度就能從基因水平上調(diào)控細(xì)胞的分化. 由于電場驅(qū)動下的切應(yīng)力受腔高影響較小, 這樣在使用電場驅(qū)動時勿需對腔高作過多要求, 但可以適當(dāng)調(diào)控腔高以保證合適的流率. 壓力梯度驅(qū)動下的切應(yīng)力受腔高的影響較大(正比關(guān)系), 且壓力梯度驅(qū)動幅值控制為460 Pa以下時切應(yīng)力幅值在1 Pa以下, 減小腔高甚至可以接近很低的切應(yīng)力水平(見圖7(b)). Gao等[5]發(fā)現(xiàn)極低切應(yīng)力(10-3Pa)能促使MSCs的遷移和成骨分化,這種極低切應(yīng)力是非常值得關(guān)注的. 例如在人靜坐時, 對骨組織的力刺激僅來源于肌肉的收縮, 相比運(yùn)動狀態(tài), 這種微小的外力極易產(chǎn)生較低的切應(yīng)力刺激. Zheng等發(fā)現(xiàn)MSCs在切應(yīng)力的刺激下會產(chǎn)生收縮和再擴(kuò)散現(xiàn)象, 如實驗中對細(xì)胞施加不同的切應(yīng)力(1.3 Pa, 9.8 Pa和14.7 Pa)時會影響細(xì)胞開始收縮的時間, 并發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力越大細(xì)胞從接種到開始收縮的時間越短. 考慮到高強(qiáng)度電場取值的困難, 壓力梯度驅(qū)動所得的腔壁切應(yīng)力較小等情況, 可以采用力–電協(xié)同驅(qū)動的方式來達(dá)到細(xì)胞組織工程所需要的切應(yīng)力刺激水平.

在研究載荷驅(qū)動頻率對細(xì)胞生長的影響時,Tanaka等發(fā)現(xiàn)外部物理場驅(qū)動頻率為2 Hz時最有利于成骨細(xì)胞的礦化. 結(jié)合圖5(c)和圖7(d), 頻率的改變對腔壁處流速和切應(yīng)力的影響均較小, 因此頻率對細(xì)胞的響應(yīng)通路不是通過改變流速和切應(yīng)力的大小來實現(xiàn)的. 壓力和電場驅(qū)動頻率為2 Hz時均能得到較大的流率, 因而此頻率可以為灌流培養(yǎng)過程提供設(shè)計參考. 由此可見: 細(xì)胞對載荷幅值的敏感性要比對載荷頻率的敏感性強(qiáng). 本文選取的溫度值在37℃左右小幅波動, 對切應(yīng)力的影響可以忽略(如圖7(e)). Stolzing等研究也發(fā)現(xiàn)在37℃的基礎(chǔ)上適當(dāng)降低溫度不影響MSCs的活性, 但分化程度增加、氧化損傷的積累降低、細(xì)胞凋亡減少. 溫度降低時, 培養(yǎng)液黏度會增大, 流速、流率隨之減小,但減小的幅度不大(見圖4(d)、圖5(d)、圖8(e)), 所以在實際的灌流培養(yǎng)中可根據(jù)細(xì)胞的具體需要適當(dāng)調(diào)控培養(yǎng)溫度. 另外, 在微流控培養(yǎng)腔中, 利用電場進(jìn)行驅(qū)動時, 通常是通過對浸入培養(yǎng)液中的電極施加電壓信號實現(xiàn)的. 而在這個過程中當(dāng)電壓較高時(> 2.2V), 電極附近就不可避免地發(fā)生電化學(xué)反應(yīng),進(jìn)而會導(dǎo)致附近培養(yǎng)液pH值的相應(yīng)變化。 對于非飽和的強(qiáng)電解質(zhì)(NaCl)水溶液而言, 電解主要以水解反應(yīng)為主, 當(dāng)正負(fù)電極附近產(chǎn)生H+和OH–離子后, 在電場的作用下, 帶電離子向相反的電極運(yùn)動,這些帶電離子在各自相對的電極被完全中和. 由此可見: 電極的電解作用僅對電極附近的pH值有一定影響, 對培養(yǎng)液的整體無影響. 這與畢穎楠等的研究結(jié)果是相同的, 他們設(shè)定的溶液初始pH為7.8,電場作用10 min, 溶液的導(dǎo)電性穩(wěn)定后, 陽極處的pH值變?yōu)?.0, 陰極處的pH值變?yōu)?.5. 楊勁松等[42]通過實驗發(fā)現(xiàn)MSCs在pH值為7.2～7.4的培養(yǎng)液中生長活躍, pH值大于7.4時, 逐漸停止增殖, pH值小于7.2時, 增殖速度減慢. Lee等[43]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在pH = 7.4的環(huán)境下生理現(xiàn)象一切正常, 酸性條件下成骨細(xì)胞仍能夠進(jìn)行增殖, 但隨著培養(yǎng)基pH值的降低, 成骨細(xì)胞的活性和增殖受到抑制, 細(xì)胞凋亡增加. 可見, 細(xì)胞對堿性環(huán)境較為敏感, 但對酸性卻有一定的耐受性, 且適應(yīng)的酸性pH值有一定的可變空間. 在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時, 可將細(xì)胞接種于遠(yuǎn)離負(fù)電極的位置. 由于電解速率不變, 也可適當(dāng)增大腔高使培養(yǎng)腔的體積增大, 減緩培養(yǎng)液pH值的變化。

本文建立了力–電協(xié)同驅(qū)動下的細(xì)胞微流控培養(yǎng)腔模型, 并分析了細(xì)胞灌流培養(yǎng)在壓力梯度和電場驅(qū)動作用下流體刺激信號的傳導(dǎo)規(guī)律, 對比了兩物理場單獨和協(xié)同作用時的特點。 許多實驗研究者都嘗試施加兩個物理驅(qū)動場來探索最佳的流體刺激條件, 但是通過實驗來探索合適的刺激參數(shù)周期長、代價高且效果不明顯. 本文在外加物理場和細(xì)胞的響應(yīng)流體切應(yīng)力之間建立一個數(shù)學(xué)關(guān)系, 根據(jù)細(xì)胞的切應(yīng)力和流速的響應(yīng)范圍大致確定外部物理場的取值, 這樣可以為實驗參數(shù)的初調(diào)提供參考. 本模型的建立將細(xì)胞能感受到的流體刺激信號和外在的物理環(huán)境有機(jī)的聯(lián)系在一起, 是一個完整的信號傳導(dǎo)系統(tǒng), 在特定驅(qū)動方式下, 微流控細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的研究內(nèi)容能在這一模型下開展. 模型仍存在著以下不足: ⑴當(dāng)忽略細(xì)胞高度時, 細(xì)胞貼壁附近的流場會發(fā)生較大變化, 對切應(yīng)力結(jié)果有一定影響; ⑵固液邊界是理想無滑移的; ⑶培養(yǎng)液假設(shè)為牛頓流體, 非牛頓流體更接近真實體液的屬性; ⑷忽略了電黏性效應(yīng), 培養(yǎng)液內(nèi)的離子在壓力梯度驅(qū)動流的作用下產(chǎn)生流動電流(場), 該流動電流(場)對外加電場及流體均有影響.

5結(jié)論

人體通常處于復(fù)雜的受力(行走、靜坐、跳躍)環(huán)境中, 當(dāng)這些外載荷力學(xué)信號傳遞到組織的微觀結(jié)構(gòu)尺度時以微液流動刺激細(xì)胞響應(yīng)的方式來引起組織結(jié)構(gòu)重建或者塑建, 最終使得組織以最優(yōu)結(jié)構(gòu)適應(yīng)外部力學(xué)環(huán)境. 這是組織環(huán)境中的載荷信號傳遞及反饋機(jī)理, 但這一機(jī)理的科學(xué)量化通路還不是很清楚, 特別是細(xì)胞參與下的力學(xué)生物學(xué)機(jī)制還不是很明確. 本文建立的力–電協(xié)同驅(qū)動矩形截面流的細(xì)胞培養(yǎng)腔理論模型, 將影響細(xì)胞生長/分化的液體壓力、流速、流率、切應(yīng)力和外部物理環(huán)境(壓力梯度、電場與溫度等)聯(lián)系在一起, 可進(jìn)一步為力–電耦合刺激細(xì)胞生長/分化機(jī)制研究及細(xì)胞組織工程參數(shù)優(yōu)化提供參考. 盡管模型還存在著不足, 但初步可以得出下列參考結(jié)論:

力–電協(xié)同作用的流體刺激效果(解答)是單獨壓力梯度和電場驅(qū)動作用效果(解答)的代數(shù)疊加.

細(xì)胞培養(yǎng)腔內(nèi)流體流速、切應(yīng)力和流率均跟外部物理場(壓力、電場)的場強(qiáng)呈線性正比關(guān)系. 物理場的驅(qū)動頻率增大時, 壓力梯度驅(qū)動下的腔壁切應(yīng)力非線性遞減而電場驅(qū)動下的腔壁流速和切應(yīng)力則基本不變, 但兩場驅(qū)動下的流率均非線性減小. 可見, 細(xì)胞所感受的流體力學(xué)刺激信號(腔壁處的流速和切應(yīng)力)對載荷幅值的變化相比頻率更為敏感.

當(dāng)培養(yǎng)腔的腔高增大時, 壓力梯度驅(qū)動下的腔壁切應(yīng)力和流率分別呈線性和非線性增大, 電場驅(qū)動下的腔壁流速、切應(yīng)力及流率則均無變化.

培養(yǎng)液的溫度(35℃～39℃)對壓力、電場和力–電協(xié)同三種驅(qū)動模式下微液流動行為的影響均不明顯.

在細(xì)胞響應(yīng)范圍內(nèi), 電場驅(qū)動善于提供較大的流體切應(yīng)力幅值而壓力梯度驅(qū)動善于提供較大的流率幅值. 力–電協(xié)同作用時, 可以聯(lián)合壓力梯度和電場驅(qū)動的調(diào)控優(yōu)勢.

文獻(xiàn)來源力學(xué)學(xué)報 doi：10.6052/0459-1879-17-317作者：王兆偉 武曉剛等（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）