細胞微環(huán)境酸化是惡性腫瘤的特征之一，與正常細胞的氧化磷酸化代謝途徑不同，腫瘤細胞的代謝方式主要為糖酵解，其代謝終產物以乳酸為主。乳酸的大量產生及排泄障礙使腫瘤細胞處于較低的ｐＨ微環(huán)境中。腫瘤微環(huán)境的酸化不僅影響癌細胞的代謝和遷移，而且影響化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。因此，建立腫瘤微環(huán)境酸化實時監(jiān)測模型對腫瘤的代謝和治療具有重要意義。

腫瘤細胞的生長環(huán)境空間狹小、液體量少，其ｐＨ值難以用傳統(tǒng)的電化學ｐＨ計測出。目前，微量ｐＨ檢測方法主要包括ｐＨ敏感微電極法、ｐＨ敏感熒光染料法和核磁共振法等方法，這些方法需要特殊的設備，且操作復雜、成本昂貴，很難在一般實驗室中開展。現(xiàn)有的腫瘤微環(huán)境酸化檢測方法缺少仿真３Ｄ結構，不能模擬細胞的擴散屏障所導致的酸性代謝產物蓄積，且難以實時檢測，結果偏差較大。

微流控芯片技術因具有結構設計靈活和規(guī)模集成的特點逐漸成為細胞研究的重要手段。本研究以微流控芯片為平臺、海藻酸鈉水凝膠為載體，乳腺癌ＭＣＦ?７細胞為研究對象，成功構建了細胞生長的微環(huán)境。同時利用芯片通道的連續(xù)灌流模擬體內的微血管系統(tǒng)，以及時提供營養(yǎng)、排除廢物。同時將造價低廉的非電化學ｐＨ指示器引入微流控芯片中，通過固定光源拍照，將顏色信號轉化為ｐＨ值，實現(xiàn)對微環(huán)境ｐＨ值的實時監(jiān)測。

１實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

激光共聚焦顯微鏡、ＡＵ２７００全自動生化分析儀；聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）前體及引發(fā)劑；硝酸纖維素薄膜；ＦＥ２０酸度計；ＴＳ?２Ａ微量注射泵。

吖啶橙（ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ，ＡＯ）、溴化乙錠（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）；乳腺癌ＭＣＦ?７細胞、乳房ＢＨＬ?１００細胞；海藻酸鈉、明膠、胰蛋白酶、氯化鈣（ＣａＣｌ２）、磷酸二氫鈉（ＮａＨ２ＰＯ４）、磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰ百里酚藍、酚酞、溴百里酚藍、甲基紅、氫氧化鈉（ＮａＯＨ）、磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）、臺盼藍染液；ＤＭＥＭ培養(yǎng)基、ＭｃＣｏｙ?Ａ培養(yǎng)基；所有溶液用二次滅菌的蒸餾水配制。

1.２芯片制作

芯片采用標準軟蝕刻加工技術，即在玻璃板上旋涂ＳＵ８光膠，然后遮蔽含有微通道圖形的掩膜，曝光及顯影處理后得到ＳＵ８模具。在含有ＳＵ８結構的基板上澆注ＰＤＭＳ，獲得微結構。芯片包含３層結構（見圖１ａ），頂層灌流通道的長、寬、高分別為４ｃｍ、１４０μｍ、１８０μｍ，中央厚度為２２０μｍ，底部有一個６ｍｍ×６ｍｍ的方形凹槽，通道末端為直徑２.５ｍｍ的圓形通孔，作為ｐＨ檢測口；中間層有一個５ｍｍ×５ｍｍ的方形通孔，作為細胞培養(yǎng)池；底層是玻璃平板。中間層與底層結合將直徑５ｍｍ的紙片分裝于中間層底面的凹槽內。中間層和底層等離子處理后封接，中間層ＮＣ膜分別用０.１％（質量分數(shù)）明膠和２％（質量分數(shù)）海藻酸鈉溶液處理并烘干，與頂層封接后得到芯片。

1.3芯片實驗操作

先將微量注射器、毛細管和制備好的芯片于９０℃烘烤１ｈ后，置于紫外燈下照射過夜。乳腺癌ＭＣＦ?７細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞進入指數(shù)成長期后制成密度為１×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ的細胞懸液。將２００μＬ細胞懸液緩慢注入芯片中，排除多余液體后放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)２ｈ，向芯片通道緩慢引入４０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，引發(fā)海藻酸鈉聚合，以３０μＬ／ｈ的速度進行連續(xù)灌注培養(yǎng)（見圖２）。

圖２芯片灌流示意圖

1.4細胞培養(yǎng)分析

細胞連續(xù)灌流培養(yǎng)５ｄ后，將熒光染液ＡＯ?ＥＢ（１∶１，ｖ／ｖ）注入芯片通道染色１０ｍｉｎ后，將芯片置于激光共聚焦顯微鏡下檢測，觀察芯片培養(yǎng)池內部細胞的結構形態(tài)。同時為考察芯片灌流與普通靜態(tài)培養(yǎng)的差異，將相同數(shù)量的細胞放入培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，于５ｄ后將其熒光染色，同芯片培養(yǎng)情況進行對比。

將細胞分別培養(yǎng)１～７ｄ后，拆開芯片，從細胞培養(yǎng)池中取出水凝膠微球于干凈的離心管中，加入圖３細胞熒光染色圖（放大倍數(shù)１０×１０）生理鹽水使水凝膠微球溶解，再加入適量胰酶消化細胞團塊，以２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ后，沉淀重懸于２００μＬＰＢＳ溶液，混勻，滴加臺盼藍染液染色，加入細胞計數(shù)板計數(shù)總細胞數(shù)及存活細胞數(shù)。細胞存活率為存活細胞數(shù)與總細胞數(shù)的百分比。細胞增殖率（ｐ）是培養(yǎng)不同天數(shù)的細胞數(shù)（ｎｄ）相對于前一天的細胞數(shù)（ｎｄ－１）增加的比率，即ｐ＝（ｎｄ－ｎｄ－１）／ｎｄ－１×１００％。

1.5ｐＨ檢測器構建

稱?。?/span>.５ｍｇ百里酚藍、１０ｍｇ酚酞、６ｍｇ溴百里酚藍、１.２ｍｇ甲基紅，加入１０ｍＬ９５％（ｖ／ｖ）乙醇水溶液，用０.０１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ滴定，直至溶液變?yōu)榫G色，將此溶液作為指示劑。將指示劑定量滴入芯片通道出口的ｐＨ檢測器后，隨ｐＨ值的不同而呈現(xiàn)不同顏色。將芯片插入帶有固定光源的拍照裝置（見圖１ｂ）進行拍照后，通過ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ２軟件分析照片的紅綠藍色彩（ＲＧＢ）模式值，作標準曲線，將光學數(shù)值轉變?yōu)椋穑戎?，從而實現(xiàn)ｐＨ值的測定。

1.6微環(huán)境酸化檢測

以３０μＬ／ｈ的灌流速度持續(xù)培養(yǎng)細胞，分別收集１、２、３、４、５、６、７ｄ時的灌流液，比較其乳酸水平和ｐＨ值的對應關系，同時在相同的培養(yǎng)條件下比較乳腺癌ＭＣＦ?７細胞和正常乳房ＢＨＬ?１００細胞在７ｄ內的微環(huán)境ｐＨ值的變化情況。同時通過降低灌流速度，考察其對微環(huán)境酸化情況的影響。

２結果與討論

2.1３Ｄ腫瘤細胞微環(huán)境的模擬

2.1.1腫瘤間質的模擬

明膠處理過的ＮＣ膜具有親水作用，在疏水性ＰＤＭＳ材料上形成親水區(qū)，一定濃度的細胞懸液通過通道灌流進入ＮＣ膜區(qū)域后，在重力和表面張力的作用下迅速鋪滿整個細胞培養(yǎng)池。細胞懸液進入培養(yǎng)池后，與ＮＣ膜上的海藻酸鈉逐漸混合，當接觸到Ｃａ２＋時海藻酸鈉固化為水凝膠微球，為３Ｄ細胞培養(yǎng)提供支撐。水凝膠微球中的明膠和海藻酸鈉含有選擇素和整合素成分，具有促進細胞黏附的作用。水凝膠微球為細胞生長提供了適宜的間質硬度及支撐、連接和營養(yǎng)作用，同時可避免流體剪切力對細胞的傷害，很好地模擬了體內腫瘤間質。

2.1.2腫瘤實質的模擬

體內細胞均為３Ｄ立體式生長而非平面生長。將芯片進行灌流培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，均培養(yǎng)１ｄ和５ｄ，分別向各自細胞培養(yǎng)池中引入ＡＯ?ＥＢ（１∶１，ｖ／ｖ）染液染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察，比較兩種培養(yǎng)條件下細胞培養(yǎng)池中細胞與間質、細胞與細胞形態(tài)學結構的變化和不同（見圖３）。結果表明，在灌流條件下，培養(yǎng)１ｄ時，乳腺癌細胞由于生長時間尚短并未聚集形成微球（圖３ａ）；而培養(yǎng)５ｄ時，細胞聚集生長，形成大小不等的微球（圖３ｂ），提示細胞呈３Ｄ立體式生長，與體內細胞生長方式接近。而在靜態(tài)條件下，培養(yǎng)１ｄ時（圖３ｃ）與灌流培養(yǎng)相比，二者無明顯差別；但隨著培養(yǎng)時間的增加，灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)下的細胞雖然在成球速度上差別不大，但細胞存活率明顯提高（圖３ｄ），說明灌流培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)更接近體內細胞的生長狀況。

圖３細胞熒光染色圖（放大倍數(shù)１０×１０）

2.2細胞生長分析

在灌流速度為３０μＬ／ｈ時，分別連續(xù)培養(yǎng)１、３、５、７ｄ，計算細胞的存活率；在此條件下，連續(xù)灌流培養(yǎng)７ｄ，計算細胞的增殖率（見圖４）。結果表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞存活率逐漸下降，但一直保持在９０％以上；細胞在第１ｄ時的增殖率最高，達到４５％，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞增殖率逐漸下降，但仍保持在２０％以上。細胞的密度隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而持續(xù)增加，說明細胞在水凝膠微球中不斷增殖，與２Ｄ細胞培養(yǎng)相比，由于營養(yǎng)成分和生長空間的限制，倍增時間顯著緩慢。

圖４灌流培養(yǎng)下細胞的（ａ）存活率和（ｂ）增殖率（ｎ＝３）

2.3微環(huán)境的酸化檢測

將濃度為０.２ｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４和Ｎａ２ＨＰＯ４按適當比例混合，配制ｐＨ值為６.５～７.４的系列標準溶液。ｐＨ檢測器中加入定量的指示劑和標準溶液后，因ｐＨ值的不同而顯示出不同顏色，通過軟件分析不同ｐＨ值對應的ＲＧＢ模式中的紅（Ｒ）、綠（Ｇ）、藍（Ｂ）值。研究表明，Ｒ值與ｐＨ值的關系最為密切，將Ｒ值取對數(shù)后與ｐＨ值繪制標準曲線（見圖５），可獲得不同顏色對應的ｐＨ值。

圖５ｌｇＲ與ｐＨ值的關系（ｎ＝３）

在灌流速度為３０μＬ／ｈ時，連續(xù)培養(yǎng)乳腺癌ＭＣＦ?７細胞７ｄ，每天測定癌細胞的ｐＨ值和乳酸水平（見圖６）。結果表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，乳腺癌ＭＣＦ?７細胞微環(huán)境的ｐＨ值逐漸下降；在６ｄ時，逐漸形成一個相對穩(wěn)定的酸化微環(huán)境，腫瘤細胞在此酸化微環(huán)境下仍能正常增殖。在相同的條件下培養(yǎng)乳房ＢＨＬ?１００細胞，其微環(huán)境的ｐＨ值始終保持在中性范圍內（圖６ｂ），與腫瘤細胞形成鮮明對比。同時對比ＭＣＦ?７細胞的ｐＨ值和乳酸水平，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著關聯(lián)（圖６ｃ），說明乳酸是引起ｐＨ值變化的重要原因

圖６乳腺癌和乳房細胞的微環(huán)境酸化情況（ｎ＝３）

本實驗考察了灌流速度對乳腺癌細胞微環(huán)境酸化情況的影響（見圖６ｄ）。在不影響ＭＣＦ?７細胞存活率的基礎上，將灌流速度降至６μＬ／ｈ，監(jiān)測其在７ｄ內微環(huán)境的ｐＨ值，由于營養(yǎng)物的供給和代謝物的排泄存在一定障礙，ＭＣＦ?７細胞在３ｄ時就形成了相對穩(wěn)定的酸化微環(huán)境。

３結論

利用微流控芯片的特性可以實現(xiàn)對細胞微環(huán)境的有效模擬和對微環(huán)境酸化進行實時監(jiān)測。本實驗借助海藻酸鈉與Ｃａ２＋固化為水凝膠的特性，為細胞生長提供支架，構建３Ｄ細胞培養(yǎng)環(huán)境，同時將價格低廉的非電化學ｐＨ檢測器集成到芯片上，實現(xiàn)對微環(huán)境ｐＨ值的實時監(jiān)測。本實驗建立的腫瘤細胞微環(huán)境酸化檢測平臺為動態(tài)監(jiān)測腫瘤細胞周圍酸堿度的變化、分析癌細胞耐藥和轉移提供了科學依據(jù)。 

文獻來源色譜ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１６．０７０１１作者：嚴偉，徐德順等（轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯(lián)系刪除）