肝臟是機體的代謝中樞，它合成血漿蛋白、調(diào)節(jié)糖原儲存、生成激素，也是藥物代謝和解毒的主要場所。肝臟毒性是化合物和藥物常見的毒性反映，是臨床前評估的一個重要指標(biāo)。傳統(tǒng)上，臨床前評估通過動物實驗進行檢測，但是其昂貴的費用、耗時耗力、與人體反應(yīng)對應(yīng)性低以及動物福利等倫理方面的問題，使得尋求新型高效的體外評價方法成為一個重要的發(fā)展趨勢。

仿生微流控器官芯片是2011年以來快速發(fā)展的一個新興研究領(lǐng)域，通過在微型芯片上建立模仿人體器官的微組織，并加入高通量檢測功能，從而使其成為一種高效、節(jié)約、仿生的生理毒理學(xué)研究與藥物研發(fā)工具。在肝芯片方面，近年也開展了大量的研究工作，并取得了一系列重要成果。

仿生微流控肝芯片的設(shè)計理念

仿生微流控芯片集仿生、小巧、高效于一體。在肝芯片的設(shè)計中，芯片的尺寸大小僅有幾厘米，通過微加工工具制造出精細的微通道網(wǎng)，驅(qū)動微量培養(yǎng)液在其中流動，精準(zhǔn)地模擬著體內(nèi)肝組織微環(huán)境，充分體現(xiàn)出細胞與細胞之間、細胞與生長因子之間的相互作用，從而仿制出類似于體內(nèi)肝臟器官的功能。

為了更好地建立能模擬肝臟組織并能產(chǎn)生類似體內(nèi)肝功能的生理學(xué)模型，研究人員還將三維肝細胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到了微流控芯片中。人體內(nèi)的肝臟按照特定的組織結(jié)構(gòu)整齊排列，在普通培養(yǎng)中肝細胞無法達到這種效果，因此采用了三維培養(yǎng)的方法來控制細胞的空間排列，以產(chǎn)生類似于天然肝臟的結(jié)構(gòu)與功能。例如，Chao等用HepG2細胞和人主動脈內(nèi)皮細胞，制造出類似于肝小葉3D結(jié)構(gòu)的微組織，它能夠代謝對乙酰氨基酚、異煙肼和利福平，并能夠通過熒光素二乙酸酯或者碘化丙啶染色對肝毒性進行評估。Yum等將肝臟隔室與含有其他組織類型的細胞隔室相互連接，用以研究肝細胞如何影響其他類型的細胞。

除此之外，一些肝芯片還開發(fā)了高通量快速監(jiān)測系統(tǒng)，以便快速評價藥物和化合物的藥效和毒性。例如，Riahi等在芯片中加入了一種高靈敏的微流控電化學(xué)免疫傳感器，能夠?qū)π酒毎a(chǎn)生的生物標(biāo)志物進行在線檢測，從而為肝毒性的長期體外評估和實時監(jiān)測提供一個新的平臺。

肝芯片的微通道灌流

肝芯片中的組織細胞是由微通道中灌流的培養(yǎng)液來滋養(yǎng)的，根據(jù)驅(qū)動這種灌流的動力來源來劃分，主要有蠕動泵驅(qū)動、重力驅(qū)動和紙基虹吸法3種方法。

蠕動泵驅(qū)動的微通道灌流

微流控芯片外接蠕動泵驅(qū)動微通道灌流是目前最常用的灌流方法，它具有成本低、小型化、通用、準(zhǔn)確和處理生物樣品靈活等優(yōu)點。蠕動泵驅(qū)動的微通道灌流能為微尺寸室中的活細胞提供可控的培養(yǎng)微環(huán)境，用于模擬組織和器官的生理功能。He等將肝臟的天然血管脈路復(fù)制于PDMS模上，構(gòu)建出微血管通道網(wǎng)絡(luò)，然后將包裹了HepG2人肝癌細胞的瓊脂糖水凝膠導(dǎo)入芯片微通道中，用外接蠕動泵連續(xù)灌注形成單向流，以形成肝小葉樣結(jié)構(gòu)，這種芯片模擬體內(nèi)血液真實的流動途徑，能更好地體現(xiàn)肝臟作為代謝器官的機能。Zhou等將生物傳感器與微通道灌流的肝細胞和星形細胞相連接，能動態(tài)監(jiān)測乙醇損傷引起的肝星形細胞分泌TGF-β信號。

重力驅(qū)動的微通道灌流 

Lee等對微流控系統(tǒng)的驅(qū)動系統(tǒng)進行改造，不使用外接蠕動泵，而是通過重力驅(qū)動將細胞灌注于芯片的微通道中。該通道具有類似于肝臟內(nèi)皮層窗口的通孔，可以使相鄰?fù)ǖ乐械母闻K聚集體互相進行營養(yǎng)交換，其優(yōu)點是芯片上的入口和出口儲存器能夠含有不同體積的培養(yǎng)基，并且由于不需要外部泵，簡化了芯片的裝置系統(tǒng)。Messner等利用重力灌流進行3D微組織肝球體培養(yǎng)，該芯片能夠使肝細胞功能穩(wěn)定保持5周以上，可用于對乙酰氨基酚和雙氯芬酸等化合物進行長期的毒性評估。Esch等在芯片上種植帶有微通道的3D肝細胞團，再將芯片置于搖擺平臺，通過±12°角的搖擺運動，驅(qū)動微通道中液體流動。Ong等研發(fā)的無泵微流體3D灌注平臺中，采用微柱陣列培養(yǎng)肝細胞，在培養(yǎng)室兩側(cè)分別設(shè)置入口貯存器和出口貯存器，通過控制入口貯存器和出口貯存器的高度差來實現(xiàn)培養(yǎng)液持續(xù)的靜水壓力驅(qū)動流動。這類重力驅(qū)動的微流控芯片不需要外部附加的蠕動泵驅(qū)動裝置，因而制備成本較低。

紙基虹吸法的微通道灌流

紙基微流控芯片是2013年開始發(fā)展的又一種新型微流控分析方法，它以紙作為芯片基質(zhì)，樣品和培養(yǎng)液在毛細管虹吸力的驅(qū)動下自主流動，不需要輔助性驅(qū)動系統(tǒng)，具有易加工、低成本、易攜帶、操作方便等優(yōu)點。例如，Vella等研制了一種基于紙基的微流控肝芯片，由塑料薄膜頂層、華氏1號層析紙制成的過濾層、雕刻有微通道的蠟?zāi)な杷畬雍退芰媳∧さ讓?層結(jié)構(gòu)組成，可用于測定血清堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總血清蛋白。NR等則在紙基芯片上制備了圖案化的疏水屏障和切割形成的親水性紙通道，通過這些通道，微量樣品和培養(yǎng)液被引導(dǎo)至特定的檢測區(qū)，在紙基板上自主分離和濾過，從而快速、半定量地監(jiān)測樣本中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。然而，紙基芯片存在著一大缺點，就是僅能進行簡單指標(biāo)的測定，不適用于復(fù)雜和多步驟的檢測。

比較上述3種灌流方式，由蠕動泵驅(qū)動的微通道灌流可以精確控制培養(yǎng)液的流動速度，為肝芯片培養(yǎng)室中的細胞提供可控的組織微環(huán)境，也減少了細胞受到的剪切力傷害，其主要缺點是需要連接復(fù)雜的設(shè)備，成本高，占據(jù)空間面積大；重力驅(qū)動的微通道灌流不需要復(fù)雜的外部連接裝置，芯片的培養(yǎng)和后續(xù)觀察比較方便，但是培養(yǎng)液的流速不夠穩(wěn)定，容易出現(xiàn)細胞脫落、細胞損傷等異常情況；紙基虹吸法微通道灌流發(fā)展時間最短，它利用毛細管虹吸力驅(qū)動引起介質(zhì)流動，只需要微量培養(yǎng)液即可進行檢測，成本低，操作簡單方便，缺點是只適用于進行簡單的檢測。目前，蠕動泵驅(qū)動的微通道灌流仍是主要的微流控肝芯片作用模式，而重力驅(qū)動的微通道灌流正在快速發(fā)展和提高之中。

肝芯片的細胞體系

肝臟是復(fù)雜的組織器官，由多種組織細胞構(gòu)建形成，目前研制的仿生類肝芯片只能模擬其中的部分機能，單細胞微團、多細胞共培養(yǎng)體系、多器官集合體系分別模擬了單種肝細胞、條索狀肝組織結(jié)構(gòu)、肝與其他器官集合體的代謝機能。

單細胞微團 

在微流控芯片中，最常采用的細胞體系是單細胞微團，即只用一種組織細胞構(gòu)建細胞微球體。例如，在哈佛大學(xué)wyss研究所研發(fā)的仿生微流控肝芯片中，采用光交聯(lián)明膠甲基丙烯?；z包裹HepG2細胞或C3A細胞制成球狀體，再用生物打印機將這種球狀體排布于微流控芯片上，通過檢測特異性標(biāo)志物的變化評估肝的毒性。在這種體系中，球狀體能夠存活30 天以上，適合于進行長期毒性的評價。同時，15mM對乙酰氨基酚的毒性測試結(jié)果表明，其研究數(shù)據(jù)與大鼠在體實驗中的研究結(jié)果相近。在另一項研究中，Tong等首先制備肝細胞微球，再將這些微球用聚乙二醇(PEG)和半乳糖進行表面修飾改性，最后將修飾后的肝細胞微球交聯(lián)于蓋玻片或包被于多孔薄膜進行固定；在微流體灌流時，這種固定化的肝細胞微球體系由于不易流失細胞而質(zhì)量穩(wěn)定。單細胞微團體系構(gòu)建簡單，便于快速和準(zhǔn)確地開展單種細胞機能特性和藥物效應(yīng)的檢測，但其球狀體形態(tài)不利于內(nèi)部細胞的營養(yǎng)物質(zhì)交換，也不適用于研究細胞間的相互作用。

多細胞共培養(yǎng)體系 

為了體現(xiàn)器官中細胞間復(fù)雜的相互聯(lián)系，研究人員開發(fā)了多細胞共培養(yǎng)體系，將肝細胞與其他支持細胞按一定比例共培養(yǎng)，從而重現(xiàn)體內(nèi)肝臟組織中復(fù)雜的細胞間聯(lián)系，也有利于維持肝細胞的活力與功能。Liu等將大鼠肝細胞、NIH－3T3鼠胚胎成纖維細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，形成了能夠分泌白蛋白和尿素的類肝球狀體，其分泌CYP450的能力能保持15 天，可用于預(yù)測藥物清除率和藥物介導(dǎo)的CYP450活性調(diào)節(jié)。Yip等使用懸滴法，將肝癌細胞與成纖維細胞混合均勻，然后包裹于膠原水凝膠中進行共培養(yǎng)，在抗癌藥物的藥效測試中，這種肝癌基質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系比單純的肝癌細胞體系呈現(xiàn)更強的耐藥性。Ma等用HepG2 細胞和主動脈內(nèi)皮細胞，共培養(yǎng)制造出3D肝小葉樣微組織芯片，它可以模擬肝臟中通過內(nèi)皮細胞共同代謝所產(chǎn)生的肝毒性。楊興元等采用微納加工技術(shù)，制備三維微圖案化芯片基板，在芯片上實現(xiàn)了間充質(zhì)干細胞與肝癌細胞的非接觸共培養(yǎng)和細胞圖案化生長，用于研究干細胞的歸巢效應(yīng)。Grix等采用立體平版印刷術(shù)結(jié)合生物打印方法，將肝細胞和星狀細胞打印到帶有中空微流體通道的水凝膠中，培養(yǎng)液經(jīng)通道系統(tǒng)灌流滋養(yǎng)組織細胞，這種類肝芯片很好地模擬了肝臟組織靜態(tài)條件下的機能特性。通過多細胞共培養(yǎng)體系建立肝細胞與非實質(zhì)細胞共存的生長體系，有利于類肝組織的結(jié)構(gòu)機能穩(wěn)定，但這種微體系的構(gòu)建具有很高的技術(shù)要求。

多器官集合體系

機體是一個整體，完整動物的藥物代謝和毒性作用是多個器官共同作用的結(jié)果，多器官集合體系將肝臟模型與其他器官或組織的模型相結(jié)合，形成多種器官組織細胞的共培養(yǎng)，以探究各個器官之間的相互聯(lián)系。2015年起，研究人員更是將多種器官模型裝載在同一個微小的芯片上，制造出能評估多器官毒性的多層芯片。Maschmeyer等制備了模擬腸、皮膚、肝和腎4種器官的集合芯片，評估化合物經(jīng)腸道吸收、肝臟代謝、腎臟和皮膚排泄的體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程。Oleaga等將心臟、肌肉、神經(jīng)元和肝臟結(jié)合在一起，并將此芯片用于研究多柔比星、阿托伐他汀、丙戊酸、對乙酰氨基酚和N-乙?；g氨基苯酚的毒性作用。秦建華等構(gòu)建了一種多器官集合芯片，將代表肝、腫瘤組織(乳腺癌和肺癌)和正常組織(胃細胞)的4種細胞系分別培養(yǎng)于多層分隔小室，通過微通道交聯(lián)模擬整體中的藥物代謝和靶細胞特異毒性。Satoh等則構(gòu)建了一種多通道、多器官組合芯片系統(tǒng)，采用氣動壓力驅(qū)動介質(zhì)循環(huán)，可開展多種器官的平行實驗，如抗癌前體藥物卡培他濱對小腸、肝臟、腫瘤組織和結(jié)締組織的作用。多器官集合芯片技術(shù)在微型芯片上構(gòu)建模擬多組織器官的仿生人體，能夠更好地檢測肝藥物的體內(nèi)代謝情況，深入研究藥物的生理生化機制與毒性藥效作用，縮短藥物經(jīng)細胞動物人體試驗的研發(fā)周期，大大降低研發(fā)成本。

從單細胞微團、多細胞共培養(yǎng)體系到多器官集合體系，仿生微流控肝芯片采用了越來越復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)體系，其目標(biāo)是充分模擬體內(nèi)的肝臟結(jié)構(gòu)與機能。但仿生微流控肝芯片的研究近幾年才剛剛開展，關(guān)于肝臟結(jié)構(gòu)與機能的模擬目前還處于初步階段。

仿生微流控肝芯片的應(yīng)用

仿生微流控肝芯片的快速發(fā)展是由于其重要的應(yīng)用前景，通過模擬肝臟的組織結(jié)構(gòu)與機能，這種技術(shù)可用于快速靈敏地進行肝臟生理機制研究、藥理毒理評價、肝臟代謝過程的動態(tài)監(jiān)測。

生理機制研究

仿生微流控肝芯片可用于研究肝臟的生理機制。例如，Prodanov等研制了一種由多孔膜分隔的兩個微流體室組成的微流控肝芯片，由其模擬了肝竇的微結(jié)構(gòu)與機能。Mi等使用天然可降解的鼠尾膠原(Collagen-I)和生長因子，培養(yǎng)HepG2和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，在芯片上成功構(gòu)建了肝竇樣結(jié)構(gòu)，其HepG2肝板和可控且均勻分布的EC單層結(jié)構(gòu)很好地模擬了體內(nèi)肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)和機能。Choe等研制了一種能夠重現(xiàn)藥物首過代謝的微流體腸肝芯片，該芯片由腸上皮細胞(Caco-2)和肝細胞（HepG2)兩個單元組成，單元間以多孔膜分割形成多細胞共培養(yǎng)，這種設(shè)計體現(xiàn)了藥物先通過腸腔吸收、再經(jīng)多孔膜傳輸?shù)礁闻K中代謝的體內(nèi)過程。Mandy等在微型芯片體系上建立了胃腸道肝臟其他組織的聯(lián)合系統(tǒng)，研究納米顆粒的口服吸收，結(jié)果證明: 這種體外芯片模型與人體高度相關(guān)，并能較準(zhǔn)確地評估納米粒子與人體組織的相互作用。Snouber等建立了一種肝-腎聯(lián)合芯片，用HepG2/C3a或HepaRG細胞系模擬肝臟，用MDCK細胞系模擬腎臟；該芯片用于研究肝腎間的聯(lián)合作用，如化合物經(jīng)肝代謝后的腎內(nèi)效應(yīng)。Materne等構(gòu)建了由HepaRG和肝星狀細胞共球體模擬的肝組織，已分化的NT2神經(jīng)細胞球狀體模擬神經(jīng)組織，其組成的肝腦復(fù)合芯片用于研究化合物經(jīng)肝代謝后對神經(jīng)組織的效應(yīng)。Bauer等把胰島微組織與肝臟球體以1∶4的配比，在芯片上建立了器官串?dāng)_模型，并通過測量胰島微組織釋放到培養(yǎng)基中的累積胰島素來評估肝和胰島的功能性偶聯(lián)，結(jié)果證明這兩個器官共同參與了葡萄糖體內(nèi)平衡。

藥理毒理學(xué)研究

仿生微流控肝芯片在藥物毒性評價和毒理學(xué)測試方面也有重要應(yīng)用。例如，Esch等將Caco-2和HT29-MTX細胞模擬的腸道隔室與HepG2/C3a細胞模擬的肝臟隔室集合為腸肝復(fù)合芯片，用于研究納米藥物經(jīng)腸道吸收后對肝臟的毒性作用。Vernetti等構(gòu)建了一個連續(xù)灌流的模擬肝索芯片，其中依次排布了衍生的肝細胞PHHs、星狀細胞LX-2、內(nèi)皮細胞EA．hy926和單核細胞U937，這種肝芯片可用于曲格列酮、尼美舒利等藥物毒性的連續(xù)檢測。Skardal等將與UV-可交聯(lián)水凝膠溶液混合的肝細胞引入密封的微流控通道中，經(jīng)光圖案化形成特定的類肝結(jié)構(gòu)，在7天內(nèi)采用循環(huán)介質(zhì)流維持其功能，可用于監(jiān)測乙醇損傷造成的尿素和白蛋白分泌減少，以及細胞損傷標(biāo)記增加。林金明等研制了腸肝膠質(zhì)母細胞瘤仿生系統(tǒng)來評估膠質(zhì)母細胞瘤藥物的藥效，在芯片上層用中空纖維培養(yǎng)Caco-2細胞來模擬腸道，在芯片底部用兩個小室分別培養(yǎng)HepG2細胞和膠質(zhì)母細胞瘤細胞來模擬肝臟和膠質(zhì)母細胞瘤，這個系統(tǒng)可用于研究藥物經(jīng)腸道吸收和肝臟代謝后對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用。秦建華等開發(fā)了一種新的肝腎聯(lián)合芯片，具有上下兩個聚二甲基硅氧烷層(PDMS)，分別培養(yǎng)肝細胞和腎細胞，中間以多孔膜構(gòu)成微通道分隔，肝細胞和腎細胞的代謝產(chǎn)物可通過多孔膜進行物質(zhì)交換，這種芯片可以有效評估藥物經(jīng)肝代謝后引起的腎毒性。

代謝監(jiān)控和評估

在仿生微流控肝芯片中，加入快速靈敏的檢測系統(tǒng)，可以用于高通量實時監(jiān)測。Shin等研制了一種新型肝芯片，將特制的電化學(xué)生物傳感器連接于芯片微流控系統(tǒng)，能實時檢測芯片細胞所產(chǎn)生的可溶性生物標(biāo)記物，從而連續(xù)7天在線監(jiān)測藥物在肝臟的代謝活性。Bavli等在肝芯片中嵌入磷酸化熒光微探針監(jiān)測線粒體呼吸作用，用電化學(xué)傳感器檢測代謝物葡萄糖和乳酸，對肝毒害時的線粒體損傷進行實時在線的評估。Rennert等構(gòu)建了交聯(lián)有內(nèi)皮細胞和單核細胞的復(fù)合肝芯片，在芯片微通道的出入口嵌入氧發(fā)光傳感器，對細胞中的氧消耗水平進行實時監(jiān)測，以此評價肝組織的代謝狀況。近年來，多種物理、生物化學(xué)和光學(xué)傳感器已被納入肝臟芯片平臺，用于細胞行為的自動化和持續(xù)性監(jiān)測，以實時監(jiān)測培養(yǎng)過程中肝細胞或肝細胞球體的形態(tài)和功能。將生物傳感器與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，可以到達高通量藥物檢測的目標(biāo)，提高藥物毒性評價和毒理學(xué)測試方面的檢測效率。

展望

仿生微流控器官芯片是基于組織工程、生物材料和微流體力學(xué)前沿技術(shù)發(fā)展起來的一個新興領(lǐng)域，它具有方便、靈敏、快速、高通量等優(yōu)點，在藥效和毒性評價中具有重要的應(yīng)用前景。目前，仿生微流控肝芯片尚處于研究的起始階段，在進入實際應(yīng)用前還有許多關(guān)鍵性的技術(shù)問題需要解決。

1)如何在芯片中達到與生理相關(guān)的細胞密度，從而構(gòu)建出體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)與機能，是有待解決的核心問題。這涉及復(fù)雜的多細胞聯(lián)系，而且在體外實現(xiàn)細胞的三維立體生長也是一大難題?？赡艿慕鉀Q方案是：采用原代肝細胞或干細胞誘生的肝細胞作為優(yōu)質(zhì)細胞來源，以最大限度地維持細胞的體內(nèi)生理特性；采用組織支架建立細胞的三維培養(yǎng)也是一個很有潛力的發(fā)展方向，目前常用海藻酸鹽、膠原、明膠甲基丙烯?；?GelMA)和聚乙二醇(PEG)等生物大分子作為構(gòu)建支架的材料。

2)如何實現(xiàn)芯片質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，是另一個重要的問題。這方面目前主要的關(guān)注點有：一是改進芯片基板的制備材料，如將具有自發(fā)熒光的PDMS更改為玻璃等其他透明材料；二是加強細胞培養(yǎng)中的無菌管理，如研制全封閉無泵芯片；三是改善芯片的保存和運輸技術(shù)，如創(chuàng)建低溫儲存肝芯片。

隨著研究工作的不斷進展，仿生微流控器官芯片技術(shù)將越來越趨向成熟，有可能作為動物實驗體外替代模型，在化合物藥效和毒理評價中得到實際應(yīng)用。

文章來源：國際仿生工程學(xué)會（微信公眾號）轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除