干細胞注射用來治療關(guān)節(jié)軟骨損傷是一種可以促進組織再生的有前途的方法。然而，由于高細胞凋亡速率，軟骨缺損處低保留性以及不完全的成軟骨能力限制了這種技術(shù)的應(yīng)用。注射后高細胞死亡率主要是因為剪切力以及軟骨缺損部位的炎癥環(huán)境。原位形成水凝膠已經(jīng)被用來提高干細胞存活率，但是這些水凝膠在注射后幾分鐘內(nèi)必須形成有效的交聯(lián)，從而防止細胞遷移造成的異位成軟骨。

為了解決這些問題，生物可降解的微粒及其表面粘附的細胞被用來促進組織缺損修復(fù)。這些微粒分散在可粘附膠中，而最新的進展則是將水凝膠制成微凝膠，通過微流控裝置將細胞先包裹進微凝膠中，促進細胞增值及分化，然后再將這些微凝膠注射進缺損部位。近來，澳大利亞莫納什大學Jessica E. Frith和John S. Forsythe教授團隊使用一種簡易的，低成本的微流控技術(shù)合成一種由明膠降冰片烯（GelNB）組成，聚乙二醇（PEG）為交聯(lián)劑的可見光固化微凝膠。此外，該團隊還發(fā)現(xiàn)這項微流控技術(shù)可以快速原位封裝人骨髓間充質(zhì)干細胞，并且這些細胞在GelNB微膠中軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基下呈現(xiàn)高成軟骨能力，特別是成透明軟骨。

首先，該團隊利用可見光（400-500nm）交聯(lián)，基于雙正交硫醇-烯反應(yīng)合成了明膠水凝膠體系（圖 1A），該體系擁有天然的細胞可粘附能力，更單一的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此外，降解性測試發(fā)現(xiàn)該水凝膠可以提供一個靈活的培養(yǎng)環(huán)境，可以幫助細胞遷移及分化（圖1D）。其次，該團度制備了以200ul微量管為基礎(chǔ)的微流控裝置（圖 2）。

Figure 1. GelNB hydrogelthiol?norbornene photoclick reaction andthe bulk gel characterization.  (A)Schematic representation of the chemical structures and gel networkpost-photopolymerization: Norbornene functional groups were conjugated with primary amine groups on gelatin. Thiol functional groups were on the two endsof the PEG chain. (B) UV?vis measurements of LAPphotoinitiator. (C) Photorheology measurements of storage modulus  (G′) and loss modulus(G″) of the bulk hydrogel. (D) Degradation profile ofthe bulk gels incubated in DPBS at 37 °C.

Figure 2. Pipette tip-based microfluidic device fabrication. (A) Lowcost consumables: PTFE tubes ×2, silicone tube ×1, pipet tip ×1, mold ×1, and needles ×2. (B) Core pipet chamber.(C) Nozzle of the device. (D) Assembled final device.

該團隊通過此裝置制備出GelNB微凝膠，通過控制油相流速可以生成直徑不同的微凝膠，油相流速越大（16mL/h），微膠直徑越?。?20 ± 9 μm）（圖 3A-D）。通過使用瓊脂糖模體發(fā)現(xiàn)注射這些微膠后可以填充在其中，證明其可注射性（圖 3F）。

Figure 3. GelNB microgel characterization.(A) GelNB microgels size distribution in oil fabricated with high oil flowrates. (B) GelNB microgels size distribution in oil fabricated with low oilflow rates. (C) GelNB microgels generated with high oil flow rates size distribution in DPBS after MQ water washing. (D) GelNB microgels generated withlow oil flow rates size distribution in DPBS after MQ water washing (scale bar:200 關(guān)m). (E) Swelling and degradation profile of GelNB microgels (low oil flow rate) incubated in DPBS at 37 ?C.(F) Demonstration of the injectability of GelNB microgels: (i) agrose gel witha cavity inside mimicked articular cartilage defect; (ii) generated microgels redispersed in DPBS after washing and loaded into a syringe; (iii) microgels injection through a hypodermic needle; (iv) microgels occupied the wholecavity.

該團隊通過這種方法將細胞封裝進微凝膠中（圖 4A-B），在第一天大多數(shù)封裝的細胞都是存活的，證明這項封裝技術(shù)具有很好的生物相容性，而在培養(yǎng)第7天，細胞存活率有一定的提升，這說明CelNB微凝膠適合細胞長期培養(yǎng)（圖 4D-E）。

從載細胞微凝膠第一天的3D重建圖像以及強度曲線分析中可以看到，細胞在GelNB微凝膠中均勻分布（Figure 5A-i,B-i），然而，七天后大部分的細胞都存在微凝膠的表面，并且沒有在微凝膠內(nèi)部觀察到死的細胞，說明細胞發(fā)生了遷移（Figure 5A-ii,B-ii）。這種遷移過程并沒有在大體積GelNB水凝膠中發(fā)現(xiàn)（凝膠厚度 ~3 mm）。

封裝后對細胞分化能力檢測發(fā)現(xiàn)，相比于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后二型膠原表達明顯增高（Figure 6）。二型膠原被廣泛認為是軟骨分化途徑中的標志物，關(guān)節(jié)軟骨中95%的成分都是二型膠原。

Figure 6.hBMSCs protein deposition immunostaining in GelNB microgels with basal and chondro-inductive supplement media. (A) z-stack fluorescent images of hBMSCsafter 7 days culture in basal media with nucleus (blue) (i), type I collagen (red) (ii), and type II collagen (green) (iii) staining. (B) z-stack fluorescent images of hBMSCs after 7 days culture in condro-inductive mediawith nucleus (blue) (i), type I collagen (red) (ii), and type-II collagen (green) (iii) staining. Scale bar: 200 μm.

本研究由澳大利亞莫納什大學Jessica E. Frith和JohnS. Forsythe教授團隊完成，并于2017年2月22日在線發(fā)表于ACS Applied Materials ＆ Interfaces。

論文信息：

Fanyi Li, Vinh X. Truong, Helmut Thissen, JessicaE. Frith*, John S. Forsythe*. Microfluidic Encapsulation of Human MesenchymalStem Cells for Articular Cartilage Tissue Regeneration. ACS Applied Materials& Interfaces. 2017; 9: 8589?8601.