目前臨床微生物的檢測以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，通過樣本接種、培養(yǎng)，分離單菌落后，通過形態(tài)、生化反應(yīng)或質(zhì)譜鑒定菌種，進而通過紙片法、E-test或微量肉湯稀釋法獲得藥敏結(jié)果。這種傳統(tǒng)培養(yǎng)-鑒定-藥敏的方式，雖然結(jié)果可靠，微生物實驗室的“金標準”，但手工操作復(fù)雜、出結(jié)果時間長，人工成本和時間成本成為了微生物發(fā)展的重要制約因素。難以做到入院常規(guī)篩查病原體，易導(dǎo)致漏檢，且感染患者也難以動態(tài)監(jiān)測治療效果；臨床重癥患者通常只能經(jīng)驗用藥，在2-3天獲得病原學(xué)依據(jù)后再按需調(diào)整抗生素，易導(dǎo)致用藥無效、誘導(dǎo)耐藥、過度醫(yī)療等情況，患者增加醫(yī)療花費，造成較大的社會和經(jīng)濟負擔(dān)。

反觀臨床生化實驗室，在20世紀80年代時也是手工單樣本操作，但20世紀90年代以后，臨床開始應(yīng)用生化流水線，樣本檢測效率極速提升，出現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，大大促進了檢驗發(fā)展進程。而臨床微生物領(lǐng)域的檢測場景，目前仍需大量人力和時間，那么是否能如生化實驗室一樣，達到自動化檢測水平？哪種檢測技術(shù)具有病原體快速鑒定和藥敏的優(yōu)勢？又能兼顧高敏感性和特異性？對于微生物檢測而言，快檢的主要關(guān)鍵問題在哪個環(huán)節(jié)？以上均是微生物實驗室面臨的挑戰(zhàn)，也是需要回答的問題。

臨床微生物實驗室有哪些快速病原體鑒定和藥敏的檢測技術(shù)？微流控技術(shù)的優(yōu)勢是什么？  

理想的檢測技術(shù)應(yīng)包括幾個層面：快速、精準、自動化、能夠獲得表型藥敏等。在鑒定方面，目前微生物實驗室可以進行快速病原體鑒定的技術(shù)，除傳統(tǒng)方法外，還包括PCR、基于免疫的檢測、熒光原位雜交、微流控芯片技術(shù)等。各方法的比較見下表1。

在藥敏方面，近年出現(xiàn)了各類新興的快速藥敏檢測方法，包括細菌納米運動檢測技術(shù)、流式細胞技術(shù)、表面增強的拉曼光譜法、單細胞形態(tài)分析技術(shù)、流式細胞分析法、DNA微陣列、多重芯片技術(shù)、PCR/real-time PCR、基因組測序等，見表2。但以上分子類的方法僅能檢測藥敏基因型，不能檢測藥敏表型，而基因型是否與表型一致，還需進一步驗證；其他藥敏表型的診斷技術(shù)，一般又需分離純菌落測定，使檢測時間延長。

綜上比較，微流控技術(shù)不論在鑒定抑或藥敏方面，均具有較明顯的優(yōu)勢。可應(yīng)用樣本同時進行病原體的鑒定和表型藥敏，可3h內(nèi)完成測定；操作具有便捷性；目前該技術(shù)雖未完全實現(xiàn)自動化，但自動化已在發(fā)展進程中，也已出現(xiàn)了掌上微流控設(shè)備，達到一體化前處理、鑒定和藥敏的目的。對于低濃度菌量的問題，通過微流控捕獲使細菌富集，可達到體系檢測閾值，具體在后文闡述。

表1微生物實驗室快速病原體鑒定技術(shù)的比較

表2 微生物實驗室快速病原體藥敏技術(shù)的比較

微流控技術(shù)通過什么原理進行檢測？

電化學(xué)微流控技術(shù)，應(yīng)用生物傳感器進行病原體檢測。優(yōu)勢是結(jié)合“基因型+表型”共同特點，不需基因擴增，檢測細菌16sr RNA鑒定病原體，擁有分子檢測的敏感性和特異性；并監(jiān)測表型藥敏結(jié)果。檢測原理是：樣本NaOH前處理使細菌裂解后，病原體核酸釋放，結(jié)合于包被了探針的檢測芯片，通過特異性捕獲探針-病原體16sr RNA-特異性檢測探針組合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，其中檢測探針上標記了熒光素的辣根過氧化物酶，在TMB（電子介質(zhì)）作用下，氧化還原H2O2（反應(yīng)底物），生成電子，可產(chǎn)生電信號大小與病原體含量呈正比，實現(xiàn)定量檢測，在電流檢測裝置中，1分鐘即可讀取電流信號值1（圖1）。16通道芯片，可根據(jù)靶點設(shè)計不同探針，同時進行多重病原體的檢測。由于檢測過程無需經(jīng)過擴增，使整體反應(yīng)和檢測時間大大縮短，將鑒定時間，由傳統(tǒng)培養(yǎng)法的18 h縮短為1 h，且操作便捷。

圖1 電化學(xué)微流控技術(shù)原理  

注：A圖為檢測芯片結(jié)構(gòu)，芯片上包被各類細菌種屬特異性捕獲探針，與細菌16sr RNA、以及檢測探針相結(jié)合，形成特異性捕獲探針-16sr RNA-捕獲探針復(fù)合物，即“三明治”結(jié)構(gòu)。B圖局部放大，顯示此“三明治”結(jié)構(gòu)在酶促底物作用下，生成電流，最終通過測定電流信號值大小，進行病原體種類和定量判斷。

微流控技術(shù)為何能夠獲得表型藥敏結(jié)果？

表型藥敏是臨床用于判斷細菌耐藥性的金標準，電化學(xué)微流控技術(shù)檢測細菌16sr RNA，因16sr RNA是細菌生長復(fù)制活躍的標志，只有生長狀態(tài)的細菌才能被識別檢測，在該技術(shù)中呈現(xiàn)電流信號的變化。分析樣本在抗生素作用下電流信號值的變化趨勢，獲得藥敏結(jié)果。樣本與待檢測抗生素短時孵育，敏感菌株生長抑制、菌量減少；反之，耐藥菌株的菌量呈增多的趨勢。電流信號升高或降低的變化，即對應(yīng)細菌生長或抑制趨勢，明確細菌對藥物的敏感性，檢測的結(jié)果反應(yīng)的是細菌表型生長特征。這類藥敏檢測兼具了16sr RNA探針基因的特異性，以及表型藥敏的穩(wěn)定性。

目前，電化學(xué)微流控體系也出現(xiàn)了熒光檢測的整合平臺，通過測定熒光信號強弱變化，明確表型藥敏結(jié)果（圖2）。通過熒光信號監(jiān)測細菌生長，能夠?qū)崿F(xiàn)單細胞層面的藥敏分析。

目前傳統(tǒng)微生物藥敏檢測時間約為48 h，電化學(xué)微流控體系僅需短時與抗生素孵育后進行監(jiān)測，不需分離純培養(yǎng)物，可直接應(yīng)用樣本檢測，將藥敏時間縮短為3 h以內(nèi)。

圖 2  快速細菌鑒定和表型藥敏的電化學(xué)體系

該微流控體系可檢測樣本實現(xiàn)單細胞層面的鑒定，并且進行表型藥敏。將樣本滴加在微流控裝置中，加入探針并與抗生素混合。結(jié)合細菌16sr RNA檢測靶點，測定熒光信號的探測器分析。通過分析對應(yīng)的熒光信號強弱的變化，明確抗生素敏感性。  

微流控體系為何具有高敏感性和高特異性？

對于生物傳感器的識別元件，微流控體系中采用核酸適配體（即16sr RNA核酸探針，結(jié)合細菌的16sr RNA片段），生成電信號，通過檢測電流值大小明確信號強度。相比其他生物傳感器識別元件，如抗體、抗菌肽、生物小分子及化合物、凝集素、分子印跡聚合物等，核酸適配體具有更高的特異性。

電化學(xué)微流控方法是一種分子診斷技術(shù)，即將標記了熒光基團的線性探針直接和細菌16srRNA雜交，產(chǎn)生電流信號。由于一個細菌內(nèi)部存在大量rRNA（約103-105個），即無需擴增，也能保證反應(yīng)的敏感性，這也是該技術(shù)直接可應(yīng)用臨床樣本，不需分離純菌株，即可進行特異性病原體鑒定的原因；也解釋了為何不經(jīng)擴增，即可達到普通PCR反應(yīng)檢測的敏感性。

但由于RNA穩(wěn)定性較差，為提高探針的穩(wěn)定性，將核酸探針更換為肽核酸探針，后者指蛋白和核酸的雜合物，這類探針可與DNA或RNA分子形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合體，由于既不是純核酸也不是純蛋白，因此該復(fù)合物同時具有抑制核酸酶和蛋白酶降解的能力，并具有熱穩(wěn)定性，也可增加雜交率。探針經(jīng)修飾改良后，微流控體系同時具備了敏感性、特異性和穩(wěn)定性。

微流控技術(shù)的臨床應(yīng)用如何？鑒定和藥敏結(jié)果是否可靠？

微流控技術(shù)直接應(yīng)用臨床樣本，進行樣本中病原體的鑒定和藥敏?，F(xiàn)在已應(yīng)用的臨床場景包括尿路感染，血流感染等。

在鑒定方面， 16通道的芯片，可針對檢測靶點設(shè)計不同特異性探針，能夠同時鑒定并定量。應(yīng)用尿液樣本，對臨床常見的腸桿菌，非發(fā)酵菌，腸球菌等測定。以傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為標準方法，對微流控技術(shù)檢測結(jié)果比較，分析其敏感性為89%，特異性達到100%。對尿液樣本檢測限達到104CFU/ml，達到臨床對尿路感染的診斷標準。針對模擬血流感染樣本，對腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵菌等，同樣可以準確鑒定。并且電化學(xué)微流控在1h內(nèi)，即可獲得病原體鑒定結(jié)果。

在藥敏方面，直接與抗生素混合進行電流值的測定。多通道芯片可混合不同種類的抗生素，通過電流值的動態(tài)監(jiān)測，同時獲得多種抗生素，如青霉素類、喹諾酮類、磺胺類等的藥敏結(jié)果（圖3、圖4）。應(yīng)用臨床尿液樣本，以微量肉湯稀釋法為標準方法，分析電化學(xué)技術(shù)對藥敏檢測的準確度，每種抗生素的準確性均達到90%以上，重大錯誤率為4%，極重大錯誤率1%，基本符合微生物性能驗證標準（其中僅重大錯誤率略高于3%的標準）。微流控技術(shù)應(yīng)用臨床樣本，3h即可獲得初步表型藥敏結(jié)果。

圖3  電化學(xué)微流控對尿液樣本快速藥敏的電流-時間變化趨勢

患者尿液與抗生素作用后形成的電流信號值，在無抗生素（紫線）、氨芐西林（紅線）、環(huán)丙沙星（綠線）和復(fù)方新諾明（藍線）藥物中生長曲線。每15 min檢測1次大腸埃希菌16sr RNA，電化學(xué)微流控的快速藥敏結(jié)果和臨床傳統(tǒng)方法VITEK2 板卡的結(jié)果一致。AMP氨芐西林，CIP環(huán)丙沙星，SXT復(fù)方新諾明。

圖4  電化學(xué)微流控對臨床尿液樣本的快速初步藥敏結(jié)果

尿路感染患者臨床樣本，應(yīng)用電化學(xué)微流控系統(tǒng)，進行快速病原體鑒定和初步藥敏。結(jié)果顯示，該樣本為大腸埃希菌陽性，且濃度約為105cfu/ml；常用抗生素中，頭孢類抗生素敏感。整個過程在3h內(nèi)完成。

NC陰性對照，EF糞腸球菌，EC大腸埃希菌，KP肺炎克雷伯菌，PA銅綠假單胞菌，PM奇異變形桿菌，EB腸桿菌目，UNI泛指所有細菌。

POS陽性對照，SXT復(fù)方新諾明，CIP環(huán)丙沙星，AMP氨芐西林，AXO頭孢曲松，GEN慶大霉素，EFP頭孢吡肟。

快速檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和面臨的問題是什么？微流控技術(shù)是如何解決的？

關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是對樣本的前處理，微流控技術(shù)應(yīng)用化學(xué)法，即溶菌酶和NaOH裂解樣本中的病原體，在8min內(nèi)達到釋放核酸的目的。已應(yīng)用在臨床尿液樣本，以及血液樣本的檢測，并分別明確了其適用性。

其次，對于復(fù)雜樣本，需充分考慮基質(zhì)的影響因素。如血液樣本，存在復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)和背景；尿液樣本中的PH值范圍差異較大，呼吸道樣本的黏性高，等等。如應(yīng)用芯片和生物傳感器進行檢測，需要避免基質(zhì)對檢測的影響。通過模擬血流樣本，應(yīng)用微流控檢測多種細菌，包括大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌等，通過分析電流信號值，明確對于全血的檢測，背景值<25 nA，特異性靶點的檢測，陽性閾值為100 nA，能夠區(qū)分陽性信號，說明背景的基質(zhì)效應(yīng)，不影響微流控檢測結(jié)果的判讀。對于尿液檢測，已通過100余例樣本，明確敏感性89%、特異性100%，說明尿液PH值的差異性并非影響電流信號值的主要因素。

另外，對于菌量低的樣本，如何富集細菌，達到技術(shù)的檢測限也是難點之一。由于血液中菌量可低至1-10cfu/ml，而微流控裝置測定菌量起始濃度范圍是104-108CFU/ml，需通過前處理的富集，使檢測限達到樣本濃度的需求。對全血樣本，通過葡聚糖沉淀紅細胞，血漿再經(jīng)離心，可20 min內(nèi)快速富集血液中的細菌，達到即使血液中菌量濃度低至10cfu/ml，也可被微流控裝置捕獲，再次提高檢測的敏感性。甚至通過微流控裝置監(jiān)測在抗生素作用下，單個細菌的生長狀態(tài)，即可在1h左右即獲得單細胞層面的表型藥敏結(jié)果，使其能夠達到血液感染樣本低濃度菌量的檢測需求（圖5）。

圖5   微流控技術(shù)監(jiān)測單細胞層面的表型藥敏

單個大腸埃希菌在微流控通道中，分別加入不同濃度的抗生素。紅色箭頭指向細菌所在位置，在低濃度氨芐西林（<2 μg/ml）作用下，細菌生長；高濃度（8 μg/ml）時，細菌裂解。比例尺5 μm。

微流控技術(shù)結(jié)合了“基因型+表型”的優(yōu)勢，即獲得分子檢測的敏感性，同時獲得表型藥敏。這種術(shù)既滿足了臨床對檢測時間的要求（1h可獲得鑒定結(jié)果，3小時可獲得藥敏）；也滿足了實驗室對操作便捷的需求。可不經(jīng)分離純菌落，直接應(yīng)用臨床原始樣本進行檢測，將傳統(tǒng)微生物鑒定時間，由18h縮短至1小時；將獲得藥敏的檢測時間，由48 h縮短至3小時，且達到單細胞監(jiān)測層面。擁有多通道的芯片體系，可多重檢測，且逐步在實現(xiàn)自動化的檢測進程中。微流控技術(shù)快速為臨床提供病原學(xué)診斷依據(jù)，可提高臨床診治效率，降低血流感染患者病死率；同時通過減少不必要的抗生素花費，減少社會經(jīng)濟負擔(dān)。未來可以充分發(fā)揮靈活設(shè)計的優(yōu)勢，繼續(xù)探究該技術(shù)在真菌、分枝桿菌等其他病原體的檢測的能力。

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