聚合酶鏈式反應 ( polymerase chain reaction，PCR) 提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規(guī)技術，極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展。

特別是90 年代后期，美國 ABI 公司推出的實時熒光定量PCR( real time PCR，qPCR) 技術及相關產品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術。

盡管經過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR 技術已經用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷；但是，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多，不能保證在反應過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的；由此導致其定量分析所依賴的基礎——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。

因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學定量分析的要求。

20 世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元；每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析。

與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應單元的平均濃度(含量)，能夠將誤差控制在5%以內，數(shù)字PCR 可以不需要對照標準樣品和標準曲線來實現(xiàn)絕對定量分析。

該技術提出至今雖然只有十幾年時間，但是由于其獨特的技術優(yōu)勢和應用前景，使得其產業(yè)化發(fā)展相當迅速。

迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產品，并已經應用于單細胞分析、癌癥早期診斷和產前診斷等研究領域。

1 數(shù)字PCR技術的原理

數(shù)字PCR(也可稱單分子PCR) 一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術不同，數(shù)字PCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。不同于qPCR 對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

最初 Vogelstein等提出的數(shù)字 PCR 是在96孔板中進行的，DNA 模板被稀釋成大約平均每兩個孔內有一個拷貝的濃度，在經過優(yōu)化的實驗條件下進行 PCR 擴增。他們設計了兩種帶有不同熒光基團的分子信標探針分別與 PCR 產物雜交，其中一種探針可以與野生型和突變型兩種產物雜交，另一種探針只與野生型雜交，通過直接計數(shù)每個孔內的熒光信號得到同一樣品中等位基因(或野生型與突變型) 的數(shù)目和比值，并利用統(tǒng)計學方法分析樣品間的顯著性差異。

目前的數(shù)字 PCR 技術主要采用分子信標和TaqMan探針兩種方式對 PCR 產物進行熒光標記。其中分子信標法 通過一對通用引物得到包括野生型和突變型 在內的 PCR 產物，再經過不對稱 PCR( asymmetric PCR) 得到單鏈 DNA 分子與兩種熒光分子信標分別雜交，利用熒光顏色區(qū)別野生型和突變型，通過具有不同熒光反應單元數(shù)量的多少和比率進行分析，這種方法也被稱為數(shù)字SNP( digital singlenucleotide polymorphism，digitalSNP) 。

TaqMan 探針法則可用于基因表達分析和單細胞多重 PCR等。Vogelstein 等提出一種基于磁珠和微乳液的固相數(shù)字 PCR 技術——BEAMing ( beads， emulsion，amplification，magnetics) 。

BEAMing 技術通過將引物化學鍵合在磁珠表面，再將單個磁珠與目標分子包裹在微乳液滴中進行 PCR 擴增，將野生型和突變型目標分子在磁珠表面進行復制。擴增結束后進行破乳，再利用流式細胞技術進行熒光計數(shù)。該技術還通過預擴增反應，提高了系統(tǒng)的靈敏度，適合用于低概率的等位基因突變分析。

BEAMing 技術可通過固液分離除去多余熒光探針，降低背景干擾，可采用普通熒光探針代替高成本分子信標和 TaqMan 探針，降低成本。但是該方法需要將單個目標分子與單個磁珠包裹在同一液滴中，增加了操作的復雜性和難度，需要進行大量條件優(yōu)化實驗。

此外， Zhong等提出通過調節(jié)熒光探針濃度實現(xiàn)多重PCR的技術，實現(xiàn)了SMA基因拷貝數(shù)變異和 c．815A＞G突變位點等五重PCR分析，突破了通常只有4個熒光通道的局限。

數(shù)字 PCR 技術原理:

 a) 數(shù)字 PCR 過程，第一步稀釋樣本分配至每個反應單元進行 PCR 反應，第二步熒光檢測；

b) 分子信標基因突變分析原理；

c) BEAMing 檢測原理

2 定量分析方法

傳統(tǒng)的qPCR通常以循環(huán)閾值( cycle threshold，CT)為定量分析的基礎，認為在指數(shù)擴增的開始階段樣品間的細小誤差尚未放大且擴增效率恒定。

對于一個 PCR 反應，到達循環(huán)閾值時其中，N0 為初始模板的拷貝數(shù)，Nt 為第CT個循環(huán)時產物的拷貝數(shù)，E為擴增效率。將上式兩邊取對數(shù)，得到對于一個特定的PCR反應，擴增效率E和CT個循環(huán)時的拷貝數(shù)Nt均為定值，因此，CT值與初始模板拷貝數(shù)N0的對數(shù)成反比關系。

然而，在PCR 擴增過程當中影響其擴增效率的因素有很多，比如酶和引物濃度等，因此很難保證擴增效率不變，導致定量PCR結果的準確度和精密度難以保證。

與傳統(tǒng)qPCR方法不同的是數(shù)字PCR采用直接計數(shù)的方法進行定量分析，也就是在PCR擴增結束后有熒光信號(產物) 記為 1，無熒光信號(產物) 記為 0，有熒光信號的反應單元中至少包含一個拷貝的目標分子。

理論上，在樣品中的目標DNA濃度極低的情況下，有熒光信號的反應單元數(shù)目等于目標DNA分子的拷貝數(shù)。

但是，在通常情況下，數(shù)字PCR的反應單元中可能包含兩個或兩個以上的目標分子，這時可以采用泊松概率分布公式( Poisson distribution) 進行計算。

上式中λ為每個反應單元中包含目標DNA分子的平均拷貝數(shù)(濃度)，p為在一定的λ條件下，每個反應單元中包含 k 拷貝目標 DNA 分子的概率。

λ由樣品溶液的稀釋系數(shù) m 決定，有 λ= cm，其中c為樣品的原始拷貝數(shù)(濃度) 。

當 k = 0 (不含目標 DNA 分子)時，上式可簡化為 p = e^－λ = e^－cm， p 可以看作是無熒光信號的反應單元數(shù)與反應單元總數(shù)的比值。

從數(shù)字 PCR 反應單元總數(shù)和有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋系數(shù)，就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度) 。數(shù)字PCR的定量方法不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值，因此不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因(house-keeping gene)和標準曲線，具有很好的準確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。

數(shù)字 PCR 的靈敏度也可以稱之為分辨率，指的是對目標基因或突變的識別能力。它除了與檢測器的靈敏度和PCR擴增效率等因素有關外，很大程度上取決于反應單元的數(shù)目n。

理論上每個反應單元至多有一個拷貝的 DNA 分子，相同體積的情況下， n = 10^2 時，該方法的最大分辨率為1 /100，也就是說樣品濃度最低為1%可以被檢出。

如果 n = 10^4 時，就可以從10^4個分子中檢測到1個靶標，即樣品濃度最低為 0. 01% 可以被檢出。因此，反應單元的數(shù)目越多，數(shù)字PCR的靈敏度越高，準確度也越高。

3 數(shù)字PCR技術分類

數(shù)字 PCR 技術提出至今，相關技術和產業(yè)化發(fā)展都非常迅速。

迄今為止，數(shù)字 PCR 技術主要有三類: 微反應室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。

微反應室/孔板數(shù)字PCR

傳統(tǒng) PCR 或定量 PCR 反應都是在96/384孔板中進行的，因此早期的數(shù)字PCR技術也采用 96 /384孔板作為反應單元。

但是數(shù)字PCR技術的靈敏度取決于反應單元的總數(shù)n，因此，理論上反應單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準確度，普通的96 /384孔板無法滿足檢測的需要。而且，在96 /384 孔板中進行的PCR反應體系通常大于5μl，由試劑消耗引起的高成本問題令人望而卻步。針對上述問題， Morrison 等在25mm×75mm不銹鋼芯片上刻蝕了3072個直徑為300μm的微反應室(如圖2a所示)，每個反應單元的體積降低至33 nl。該芯片可在商品化 PCR 儀上使用，與384 孔板的檢測靈敏度相當，但反應體積降低為原來的1/64，樣品通量提高了24倍。

隨著反應單元數(shù)目的成倍增加，反應體積從微升級降至納升級，傳統(tǒng)的操作人員采用移液器加試樣的方式已經無法滿足快速精準取樣的要求，因此需要借助高通量自動點樣儀或機械手等設備，這無疑大幅提高了系統(tǒng)的成本和操作的復雜性。

大規(guī)模集成流路數(shù)字PCR

微流控芯片技術的發(fā)展為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺。

2000年，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上設計并加工高密度微泵微閥結構(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit)。

IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點，通過多層軟刻蝕技術在芯片上加工交織的液體和氣體通道結構，可以快速并準確地將流體分成若干個獨立的單元，進行多步平行反應。

2006 年Ottesen等將IFC芯片用于數(shù)字PCR分析，通過精準控制微泵微閥的開啟和關閉，一步操作即可將一個樣本平均分配到 1176個反應單元中，每個反應單元的體積只有6. 25 nl，成功代替了傳統(tǒng)點樣儀和384孔板。

他們同時進行了6個樣本7 056個單元的平行數(shù)字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技術加工了具有10^6個結構單元的數(shù)字PCR 芯片，每個反應單元的體積降低至10 pl，芯片密度達到 440000 /cm2。

與微反應室數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，IFC的特點是通量更高，每個反應單元的體積更小，加樣更快。最近，Men等在2mm×2mm區(qū)域內加工了82000個 fl 級反應單元，進行數(shù)字PCR分析。

液滴數(shù)字PCR

液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級液滴中進行 PCR 擴增，擴增后的產物富集在磁性微球上，收集破乳后進行測序。

通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應體系，比微孔板和IFC 系統(tǒng)更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術平臺。

Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技術就是一種基于乳液PCR的數(shù)字PCR系統(tǒng)。Lu 等也采用BEAMing 和連接酶反應實現(xiàn)對 mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMingPCR 擴增后破乳，將連接不同產物的磁珠包被在聚丙烯酰胺凝膠中制成磁珠陣列進行熒光檢測。

但是，上述技術需要將單拷貝 DNA 模板與磁珠同時包裹在一個液滴中，增加了系統(tǒng)的復雜性和定量分析的難度。

Beer 等在微流控芯片通道中用油相包裹皮升級液滴，液滴中只包裹了單拷貝 DNA 模板、 PCR引物及試劑，實現(xiàn)了數(shù)字PCR 定量分析。

Hindson 等在微流控芯片中生成了20000—2000000個體積為 1nl 的液滴，然后將液滴轉移到 96 孔板中進行TaqMan PCR擴增，至終點后將液滴從 96 孔板中取出，在微流控芯片中采用流式方法使液滴順次經過雙通道熒光檢測器，以1000個液滴/s的速度進行計數(shù)。

Pekin 等設計了一種微流控芯片，可分別生成包含不同熒光探針和 DNA 模板的液滴，再進行液滴融合，他們將該系統(tǒng)用于KRAS基因突變分析。

此外，Shen 等提出了一種通過滑動芯片( SlipChip) 液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，設計了帶有微流體通道和反應單元的玻璃芯片，上下兩片之間用油相密封，通過滑動將樣品溶液從流體通道中引入反應單元，同時生成1280個體積僅為2. 6 nl的液滴陣列，在芯片上進行PCR擴增和熒光成像分析。

隨后，他們還設計了具有不同體積反應單元的 SlipChip，從1 nl變化到125nl，僅用不到 200個反應單元，理論上可以實現(xiàn)12000個等體積反應單元所能達到的檢測濃度范圍。

Yang 等還合成了凝膠微球作為反應單元進行數(shù)字 PCR 擴增和定量分析，與前述液滴相比凝膠微球體系更加穩(wěn)定和可控，易于收集和保存擴增產物。

圖 2 幾種典型數(shù)字 PCR 芯片: a)微反應室/孔板數(shù)字 PCR( OpenArrayTM); b)大規(guī)模集成微流控數(shù)字 PCR 芯片( BioMarkTM);c) 微液滴數(shù)字 PCR( QX100TM)

4 結論與展望

與傳統(tǒng)定量 PCR 不同，數(shù)字 PCR 通過直接計數(shù)的方法，可以實現(xiàn)起始 DNA 模板的絕對定量，因此特別適合用于CT值不能很好分辨的應用領域，例如拷貝數(shù)變異、突變檢測、等位基因失衡和單細胞基因表達等。

對于這些低濃度樣品，檢測通量越高，可檢測到樣品信號的概率越大，靈敏度也就越高。近幾年數(shù)字 PCR 技術發(fā)展迅猛，新技術新方法不斷出現(xiàn)，全球各大公司對有前景的數(shù)字PCR技術競爭激烈，極大地推動了該領域的產業(yè)化進程。

2006 年美國 Fluidigm 公司率先推出第一款數(shù)字 PCR 產品——基于 IFC 技術的 BioMarkTM 系列高通量基因分析芯片系統(tǒng)，將數(shù)千個微泵微閥集成到芯片上，代替點樣儀可實現(xiàn)高通量加樣、加試劑、混合等操作，可同時進行高37000個反應。

微反應室數(shù)字PCR系統(tǒng)以BioTrove 的OpenArrayTM為代表，他們用具有3072個微反應室的芯片代替最初的96 /384孔板，大大提高了檢測通量，并且降低了反應體積和試劑成本。

    2009 年，BioTrove被Life Technologies ( Applied Biosystems) 收購。

    2011 年Bio-Rad收購QuantaLife的液滴數(shù)字PCR 技術( ddPCR) ，迅速推出 QX100 液滴數(shù)字PCR產品，利用微流控芯片在油水兩相間生成約20000個液滴進行高通量數(shù)字 PCR 分析。

最近，美國RainDance Technologies公司推出了RainDropTM數(shù)字 PCR 系統(tǒng)，可生成 100 萬個皮升級液滴，系統(tǒng)靈敏度大為提高。

可以說數(shù)字 PCR 是繼測序技術之后又一個擁有巨大潛力的新興技術和產業(yè)。

但是，目前的數(shù)字 PCR 技術仍然存在一些不足，制約了該技術廣泛應用。例如，數(shù)字 PCR 自身特點決定了其分析的樣品通量很低，基本每塊芯片上萬個反應單元都是針對單一樣本的分析。而熒光檢測技術的局限性限制了多個芯片的同時檢測，因此該技術目前在常規(guī)基因表達分析中不具備優(yōu)勢。

此外，數(shù)字PCR技術的靈敏度(分辨率) 和準確性有待進一步提高和優(yōu)化，在臨床診斷中需要進行大量的比較和驗證實驗(對照傳統(tǒng)方法) 。

基于精密儀器和復雜芯片的數(shù)字 PCR 技術成本高昂，也是制約其廣泛應用的一個原因。

相信在未來的幾年里將會不斷有新的技術和產品出現(xiàn)，不斷擴展其應用范圍，使之成為新一代分子診斷工具。