1.微流控PCR, QPCR, RT-PCR & QRT-PCR簡介

最常見的DNA分析是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（或PCR）和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）。兩種方法都包含在DNA序列的特定指數(shù)擴(kuò)增中。

PCR和qPCR具有眾多應(yīng)用，例如DNA測序。直接PCR應(yīng)用之一顯然是克隆DNA序列（例如基因）。

它還可以幫助檢測到低量的DNA（例如，用于病原體檢測，如細(xì)菌或病毒）。

就一般生物分析而言，微流控為PCR分析提供了許多優(yōu)點：

①整個生物過程整合并因此被最終用戶簡化；

②高通量，多重和高度平行的分析；

③由于反應(yīng)時間較短和/或分離時間較短，分析速度更快；

④用于即時護(hù)理應(yīng)用的便攜式設(shè)備；

⑤低試劑消耗量；

⑥每次分析的全球成本降低。

2.PCR及其在微流體裝置中的應(yīng)用

2.1 PCR需要幾種常見混合物的試劑：

①DNA樣本：將從中擴(kuò)增特定序列的原始DNA

②引物：對應(yīng)于特定擴(kuò)增DNA序列兩端部分序列的一對短核苷酸序列（10-20個堿基對）。他們將因此確定具體的擴(kuò)增序列。

③核苷酸或更精確的脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）：基本上，將用于合成新的DNA擴(kuò)增子（即由PCR過程產(chǎn)生的新DNA樣品）的4種類型的DNA堿基（A，T，C，G）。

④DNA聚合酶：一種能夠通過特異性組裝核酸從單鏈DNA中作為模板創(chuàng)建新DNA鏈的酶。

一旦混合物準(zhǔn)備好，PCR基本上包含在每個PCR階段的2或3個不同溫度之間的溫度循環(huán)中：

改性：該步驟在94-98℃下進(jìn)行并導(dǎo)致DNA熔解，即分離DNA鏈產(chǎn)生兩個單獨的單鏈DNA。

退火：該步驟在50-65℃下進(jìn)行以允許引物退火至與特定擴(kuò)增的DNA序列的兩個末端對應(yīng)的特定位置處的單鏈DNA模板。退火階段可以在與擴(kuò)展階段相同的溫度下進(jìn)行，以僅使用2個不同的溫度進(jìn)行PCR。

延伸：此步驟通常在70°C左右進(jìn)行。溫度主要取決于所使用的DNA聚合酶，因為它對應(yīng)于DNA聚合酶與引物/單鏈DNA復(fù)合物結(jié)合以通過摻入周圍核苷酸合成新的互補DNA鏈的階段。

2.2 PCR微流體裝置和應(yīng)用

PCR主要依賴于溫度循環(huán)。因此集成設(shè)備的關(guān)鍵技術(shù)就是它們的加熱方法。

在DNA擴(kuò)增方法中，PCR是首先在微流控芯片上開發(fā)的，因為它是最常見和簡單的核酸擴(kuò)增方法。實際上，當(dāng)芯片上進(jìn)行PCR以利用微流體優(yōu)勢（速度（3,4），并行化（4）和靈敏度（5））時，其結(jié)果分析可以容易地在芯片外執(zhí)行。

來自Gong等煩人多重集成PCR原型

來自Pal等具有集成電泳分析的微流控PCR芯片，

3. 微流體裝置中的加熱和溫度控制系統(tǒng)

從PCR過程可以看出，溫度循環(huán)和熱化系統(tǒng)是PCR裝置的關(guān)鍵技術(shù)部分。此外，即使溫度只能在實驗前校準(zhǔn)，最好在PCR過程中監(jiān)測和控制溫度，以獲得精確和穩(wěn)定的樣品熱量。

為了進(jìn)一步使PCR微流體裝置小型化并加速熱處理，可以在其制造期間將金屬（大多數(shù)為鉑）或多晶硅的薄膜直接集成到微流體裝置中。

PCR芯片中的薄膜加熱器

激光加熱PCR液滴膜

4. QPCR及其在微流體裝置中的應(yīng)用

定量PCR（qPCR）也稱為實時PCR，但很容易與反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR，用于RNA分析）混淆。

qPCR依賴于與PCR相同的原理，取而代之的是PCR產(chǎn)物在擴(kuò)增過程中實時檢測，這歸功于與適應(yīng)性光學(xué)激發(fā)和檢測器相關(guān)的螢光受體。

嵌入劑qPCR的解析曲線分析

熒光探針機(jī)制

與PCR相比，qPCR具有更快的優(yōu)勢（PCR過程中的自動檢測），更靈敏，動態(tài)范圍更廣，重復(fù)性更好。

QPCR微流體裝置和應(yīng)用

與PCR一樣，微流體裝置能夠加速熱化過程以實現(xiàn)快速qPCR過程（20分鐘內(nèi)40個qPCR循環(huán)，商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)約1小時），有助于縮小PCR工作體積，同時保持相同的擴(kuò)增效率和靈敏度（即最小核酸濃度可檢測）比常規(guī)商業(yè)系統(tǒng)。

微流體裝置也被開發(fā)用于平行病原體檢測（水寄生蟲）使用毛細(xì)管注射和預(yù)裝引物，大大簡化了系統(tǒng)的復(fù)雜性和最終用戶的任務(wù)。

微流體qPCR裝置

5. RT-PCR＆QRT-PCR及其在微流體裝置中的應(yīng)用

PCR可用于DNA檢測，但它也可用于通過簡單地向PCR過程添加先前步驟來檢測RNA。事實上，RNA結(jié)構(gòu)非常接近DNA，但含有核糖而不是脫氧核糖和尿嘧啶堿基而不是胸腺嘧啶。而且，在其大部分生物學(xué)作用中，RNA是單鏈分子，比DNA序列短得多。通過RT-PCR進(jìn)行RNA定量的主要應(yīng)用是來自信使RNA（mRNA）和病毒檢測（許多病毒是RNA病毒）的基因表達(dá)分析。

在70年代，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，即能夠使DNA在RNA中逆轉(zhuǎn)錄的酶。因此，通過使用包含逆轉(zhuǎn)錄聚合酶和大約50℃的先前熱化步驟的PCR生物化學(xué)試劑，可以從RNA中獲得互補DNA（cDNA），然后可以像常規(guī)PCR過程那樣擴(kuò)增cDNA。

DNA和RNA之間的差異

以與PCR和qPCR相同的方式，可以在qRT-PCR過程的擴(kuò)增期間實時檢測RT-PCR產(chǎn)物。區(qū)分RT-PCR和qPCR很重要。RT-PCR以前可用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所以使用RT-PCR很容易讓人對上述過程感到困惑。所以現(xiàn)在使用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其縮寫qPCR代替實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是如此簡化的qRT-PCR。

RT-PCR：不同的RT引物類型

RT-PCR：一步和兩步法

RT-PCR和QRT-PCR微流體裝置和應(yīng)用

兩步qRT-PCR也可用于進(jìn)行病毒離片RT步驟，然后用微流控芯片進(jìn)行PCR以加速處理持續(xù)時間（15分鐘（31）30個循環(huán)，17分鐘40個循環(huán)（ 35）），同時保持商業(yè)系統(tǒng)的效率和靈敏度（31）或降低它們（35）。

一步式qRT-PCR也已經(jīng)用與熱和光學(xué)系統(tǒng)有關(guān)的聚合物微流控芯片制成，但與商業(yè)系統(tǒng)相比產(chǎn)生降低的效率（36）。其他集成系統(tǒng)通過將反應(yīng)時間縮短至35分鐘達(dá)50個循環(huán)（37），在芯片上進(jìn)行一步式雙相樣品qRT-PCR（37），將循環(huán)閾值與商業(yè)系統(tǒng)進(jìn)行比較，但不考慮效率和靈敏度。

最初，RT-PCR產(chǎn)物也可以通過比色法在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行檢測，使用免疫層析試紙條，如妊娠試驗中使用的那些（38）。這種類型的系統(tǒng)大大簡化了檢測設(shè)置，因為它不需要任何光學(xué)分析。

與免疫色譜（或側(cè)向流動）檢測相關(guān)的微流控RT-PCR測定

6. MICROFLUIDIC CONTINUOUS FLOW/FLOW-THROUGH AND OSCILLATING FLOW PCR

Microfluidic Continuous Flow/Flow-through system for 30 PCR cycles with the different heating zones pointed out

Microfluidic Oscillating flow PCR chip. The 1st RTV layer correspond to the PDMS Quake valve and the second one to the PDMS microfluidic channels for PCR sample.

7.微流控數(shù)字PCR

隨著微流體技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了處理微流體裝置內(nèi)的乳液和液滴的數(shù)字微流體。現(xiàn)在，數(shù)字PCR（dPCR）已通過多家公司商業(yè)化，專門用于超靈敏檢測。盡管如此，dPCR需要更長的加熱時間以在所有產(chǎn)生的液滴在PCR管中轉(zhuǎn)移后獲得均勻的熱化。

初期數(shù)字微流體裝置

數(shù)字PCR用于罕見突變檢測

8.微流體單細(xì)胞PCR和RT-PCR

單細(xì)胞PCR / RT-PCR的優(yōu)勢在于可以精確定量和區(qū)分每個單細(xì)胞的基因表達(dá)，即使它們代表了全球細(xì)胞群體中相對非常小的一個群體，而不會在獲得的平均基因表達(dá)中丟失通過評估細(xì)胞類型的所有細(xì)胞。因此可以檢測到非常罕見的生物事件。

單細(xì)胞RT PCR分析，來自White等，PNAS，2011

用于單細(xì)胞分析的微流體液滴qRT-PCR裝置來自Eastburn等，Analytical Chemistry，2013

微流體已廣泛用于不同的DNA擴(kuò)增過程（PCR，qPCR，RT-PCR）。微流體裝置能夠加速PCR過程，減少試劑消耗，達(dá)到高通量分析并將PCR前后分析整合在一起。