通過結(jié)合微流體，微制造和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的原理，出現(xiàn)了新一代的實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，稱為“片上器官”。器官芯片系統(tǒng)是包含活細(xì)胞的微流體裝置。與先前的體外模型相比，這些微流體裝置可以更好地概括微環(huán)境。微流體裝置特別適用于模擬生物屏障，例如血腦屏障，因?yàn)樗鼈兛梢阅M血流。  

血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能

血腦屏障（BBB）是細(xì)胞的邊界層，其排列腦微血管并將血液與腦間質(zhì)液分開。血腦屏障的主要功能是通過允許選擇性運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)，但防止血液中的有毒物質(zhì)進(jìn)入大腦，充當(dāng)物理和代謝屏障。

BBB由專門的內(nèi)皮細(xì)胞組成，其被基底膜和四種其他類型的細(xì)胞包圍：星形膠質(zhì)細(xì)胞，周細(xì)胞，神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞。這五種類型的細(xì)胞和基底膜一起構(gòu)成了神經(jīng)血管單元（圖1）。在BBB的相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間形成稱為緊密連接的密封蛋白復(fù)合物。結(jié)果，細(xì)胞彼此緊密靠近，從而阻塞細(xì)胞內(nèi)空間并阻止細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。這種高屏障緊密度是BBB的特征，對(duì)維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。屏障緊密度的局部破壞導(dǎo)致通過屏障的滲漏與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的幾種疾病相關(guān)[2]。了解和克服BBB對(duì)于治療CNS疾病至關(guān)重要。能夠暫時(shí)打開屏障，允許藥物通過并到達(dá)大腦的藥物輸送系統(tǒng)是治療CNS疾病的關(guān)鍵研究領(lǐng)域。

圖1.神經(jīng)血管單元的圖示

血腦屏障的體外模型

在人工環(huán)境中，條件可以保持在高度控制之下，并且可以獨(dú)立地研究特定行為而幾乎不受其他因素的干擾。傳統(tǒng)上，BBB已經(jīng)在體外重建為使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)置的靜態(tài)模型。微流體器官芯片裝置提供了解決先前體外許多缺點(diǎn)的解決方案楷模。這些裝置可以設(shè)計(jì)成更真實(shí)的結(jié)構(gòu)，并且它們的小尺寸更好地代表神經(jīng)血管單元中毛細(xì)血管的幾何形狀。此外，通過采用微流體而不是在本體溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，模型可以顯示生理現(xiàn)象，例如流體流動(dòng)和剪切應(yīng)力。BBB-on-chip模型的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以集成用于實(shí)時(shí)監(jiān)控的傳感器。

微流控芯片上的血腦屏障

下面介紹兩種早期的微流體裝置，這些裝置率先開發(fā)了片上BBB，并為幾個(gè)有前景的概念提供了原理驗(yàn)證。還將介紹在開發(fā)用于研究BBB的器官芯片裝置時(shí)要考慮的一些重要設(shè)計(jì)方面和驗(yàn)證參數(shù)。如今，用于片上器官應(yīng)用的即用型芯片已在市場(chǎng)上出售或可訂購定制。

據(jù)我們所知，Booth等人。是2012年首次發(fā)布BBB芯片模型并在2014年發(fā)表了一篇后續(xù)論文。如圖2所示，它們的裝置包括PDMS層中的兩個(gè)交叉通道，深度為200μm，寬度分別為2mm和5mm。兩個(gè)通道由覆蓋有纖連蛋白的多孔聚碳酸酯膜隔開。通過具有薄膜Ag / AgCl電極的玻璃載片覆蓋通道層，其中四點(diǎn)感測(cè)結(jié)構(gòu)放置在膜上。將小鼠內(nèi)皮細(xì)胞（b.End3）和鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（C8D1A）在膜的相對(duì)側(cè)共培養(yǎng)。在兩個(gè)通道中施加2.6mL / min的流速，根據(jù)本文中提供的計(jì)算，其對(duì)應(yīng)于內(nèi)皮細(xì)胞上2mPa的剪切應(yīng)力。2帶有集成的薄膜電極。此外，用免疫熒光鑒定緊密連接蛋白ZO-1，并進(jìn)行滲透性研究以確認(rèn)屏障功能。

圖2. Booth等人開發(fā)的BBB-on-chip示意圖和圖片。（轉(zhuǎn)載自Booth等人）

另一種完全整合的BBB裝置由Griep等人出版。在2013年。該裝置由兩層PDMS組成，所述PDMS包括寬度為500μm且深度為100μm的通道，其間具有涂覆有膠原的聚碳酸酯膜。將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hCMEC / D3）培養(yǎng)在膜的頂部。他們使用四根鉑絲來監(jiān)測(cè)阻抗光譜測(cè)量7天內(nèi)的TEER值。他們獲得的平均TEER值為28Vcm 2 ±1.3 SEM）。當(dāng)施加2.5mL / h的流速時(shí)，他們觀察到TEER的增加，高達(dá)120Vcm 2，對(duì)應(yīng)于0.58Pa的計(jì)算剪切應(yīng)力。

圖3.芯片層（a）和組裝芯片（b）的示意圖，以及Griep等人開發(fā)的片上BBB的圖片。（轉(zhuǎn)載自Griep等人）

用于片上器官的芯片材料

PDMS已被廣泛用于制造器上芯片器件。PDMS的一些優(yōu)點(diǎn)包括生物相容和透明（240 nm - 1100 nm），便宜且易于處理，可以高分辨率成型，并可粘合到玻璃或PDMS。。然而，它是高度疏水的，當(dāng)填充通道或?yàn)榉切孤┬酒@得緊密結(jié)合時(shí)可能是有問題的。此外，難以在PDMS的表面上沉積電極，因此玻璃通常用于具有圖案化薄膜電極的器件中。

NPG72是一種新型熱塑性材料，具有極好的片上器官應(yīng)用前景。它具有與PDMS相同的優(yōu)點(diǎn)，但不像PDMS需要幾個(gè)小時(shí)才能成型，NPG72芯片可以在幾分鐘內(nèi)完成。

芯片模型中的血腦屏障細(xì)胞

所使用的細(xì)胞類型對(duì)于構(gòu)建生物相關(guān)性模型非常重要。然而，目前尚不清楚神經(jīng)血管單元的不同細(xì)胞究竟是如何促成屏障功能的[8]。為了模仿人類BBB，使用人類細(xì)胞顯然是最具預(yù)測(cè)性的。人腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞已被廣泛表征，但可用性和再現(xiàn)性低。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）的最新進(jìn)展有望克服這些困難。

預(yù)期將內(nèi)皮細(xì)胞與來自神經(jīng)血管單元的其他細(xì)胞共培養(yǎng)是更生理學(xué)相關(guān)的表現(xiàn)，因?yàn)檫@些細(xì)胞也影響屏障的形成和維持。已經(jīng)發(fā)表了幾項(xiàng)關(guān)于微流體BBB模型中共培養(yǎng)的研究，主要是帶有星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞，還有神經(jīng)元和周細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞彼此不直接接觸，但被基底層分開。在微流體裝置中，它們可以在膜的不同側(cè)面上培養(yǎng)。然而，裝置中的膜太厚，細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸將受到限制。為了模擬細(xì)胞外基質(zhì)的3D環(huán)境，水凝膠已被用作微流體室內(nèi)的細(xì)胞接種支架。

剪切內(nèi)皮細(xì)胞的壓力

由于血壓和剪切應(yīng)力，神經(jīng)血管單元中BBB的內(nèi)皮細(xì)胞受到垂直于血管壁的力。由血流引起，在流動(dòng)方向上。已經(jīng)報(bào)道剪切應(yīng)力影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能，并對(duì)屏障形成具有積極作用。與其他類型的器件不同，片上器件器件具有適合于結(jié)合流體流動(dòng)的巨大優(yōu)點(diǎn)?；铙w血管具有圓形橫截面，而微流體裝置通常具有矩形橫截面。在具有圓形橫截面的管中，由于圓柱對(duì)稱，剪切應(yīng)力在壁上將是相等且均勻的。然而，在矩形橫截面的情況下，剪切應(yīng)力將不均勻。為了在矩形截面中獲得最均勻的應(yīng)力，通過將通道設(shè)計(jì)成通道高度遠(yuǎn)小于通道寬度，可以實(shí)現(xiàn)盡可能平坦的流動(dòng)剖面。毛細(xì)血管的生理剪切應(yīng)力為0.3-2 Pa。

經(jīng)內(nèi)皮電阻（TEER）

TEER描述了跨細(xì)胞屏障的抗性，并且通常用作驗(yàn)證參數(shù)來控制BBB模型中的內(nèi)皮細(xì)胞是否形成緊密連接復(fù)合物。如果內(nèi)皮細(xì)胞正常生長并與相鄰細(xì)胞形成緊密連接，則細(xì)胞層的細(xì)胞間隙被阻塞，電流流動(dòng)受到限制。這導(dǎo)致更高的電流阻抗，這反映在更高的TEER值中。TEER通常表示歸一化到在單位Ωcm的膜面積2，如在下面，為了便于直接比較其他模型。

在BBB片上模型中，測(cè)量TEER是一種快速，非侵入性的方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)屏障質(zhì)量的實(shí)時(shí)評(píng)估。通過在蜂窩層上施加低電流來執(zhí)行測(cè)量，同時(shí)測(cè)量電池層阻止多少電流。片上器件裝置適用于集成傳感器，其中TEER可以實(shí)時(shí)監(jiān)控，這在其他類型的裝置中是困難的。在體外 BBB的模型需要達(dá)到高于150-200Ωcm的TEER值2被認(rèn)為是可接受的模型[19]。這比報(bào)道的體內(nèi)結(jié)果低約10倍。接受低得多的TEER的原因是由于體外條件的簡化。

芯片模型上血腦屏障的滲透性

通過測(cè)試屏障對(duì)不同物質(zhì)的滲透性，片上器官模型可以直接提供關(guān)于屏障功能的信息。以易于與體內(nèi)比較的方式量化滲透性是有用的數(shù)據(jù)。穿過屏障的被動(dòng)傳輸可以從流過芯片的分析物的滲透系數(shù)來量化。值得注意的是，擴(kuò)散以外的因素可能有助于運(yùn)輸，如細(xì)胞屏障中存在間隙時(shí)的對(duì)流，以及由于通道之間溶質(zhì)濃度的差異引起的滲透流。這可以通過控制通道中的溶質(zhì)一致性并在實(shí)驗(yàn)期間在兩個(gè)通道中具有相同的壓力來避免。由于親水性化合物穿過屏障的運(yùn)輸非常受限制，因此這些用熒光示蹤劑標(biāo)記的化合物通常用于滲透性研究。然后可以用熒光顯微鏡觀察滲透性。

由MAMI項(xiàng)目博士生EmmaThomée撰寫，資助來自歐盟的Horizon 2020研究和創(chuàng)新計(jì)劃，資助協(xié)議編號(hào)為766007。 

emma.thomee [在] elvesys.com